《细胞核的分离与纯化及RNA、DNA的定量测定-20121201》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞核的分离与纯化及RNA、DNA的定量测定-20121201（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、喻娟娟生物化学与分子生物学教研室联系电话: 15836197257Email: 细胞核的分离纯化 及RNA、DNA的定量测定实验六 1. 了解细胞核分离纯化的基本原理和方法2. 掌握DNA、RNA定量测定的原理及方法3. 掌握离心机的使用一、细胞核的分离与纯化（上午）二、RNA的定量测定三、DNA的定量测定 （下午）一、细胞核的分离与纯化DNA、RNA在细胞中的分布：DNA胞核内(98%)胞质内(2%)RNA胞核内(10%)胞质内(90%)核酸的种类：DNA、RNA结论：DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。二、核酸的种类及其分布核 酸 核苷酸 磷 酸 碱 基 戊 糖 定糖法（戊糖
2、的差异）三、核酸的鉴定浓HCl 3H2O+ D核糖 糠醛 糠醛 3，5二羟基甲苯绿色化合物 RNA 水解 D核糖 + Pi + A.G.C.U地衣酚法: （1）核糖核酸RNA的测定DNA 水解D脱氧核糖 + Pi + A.G.C.U-H2O硫酸 脱氧核糖 羟基酮基戊醛蓝色化合物二苯胺法: （2）脱氧核糖核酸DNA的测定1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸（含3.3 mmol/L CaCl2） 称取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5拧檬酸液溶解并稀释 至1000ml。 2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2） 称取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5柠檬酸
3、液溶解并稀释 至1000ml。 3、核洗液：即0.05mol/L，TrisHCl（pH7.5）0.15mol/L NaCl 液。 在0.2mol/L TrisHCl pH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸 馏水稀释至1000ml。 4、 1.5拧檬酸 5、0.9NaCl 6、0.02N NaOH 7、离心机 8、水浴箱 9、常规玻璃仪器试剂与器材 用颈椎脱臼法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，除去结缔组织，尽快置 于盛有0.9%NaCl的小烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液。洗完后将肝脏一分为二， 每个小组半个肝，直接将半个肝放在小烧杯里剪碎，剪碎的肝脏放入匀浆器中，加 入 1.5
4、柠檬酸钠溶液4.5ml，反复研磨制成匀浆，从而破碎细胞。研磨完后，将匀浆 液用单层纱布进行过滤，以除去未研碎的组织。（1）肝细胞匀浆的制备（2）分离细胞质和细胞核将过滤好的匀浆液，放入普通离心机，以3500r/min的转速，离 心15min。缓慢倒出上清液（细胞质），移入另一试管中，保 留待测定核酸时使用。余下的沉淀物为粗制的细胞核，加入0.25mol/L蔗糖-拧檬酸溶 液1ml ，用玻捧搅匀，制成细胞核悬液。另取离心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml，用滴管 吸取上述核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液 液面上，再以2000r/min转速离心10分钟，倾
5、去上层液，将管倒 立于滤纸上，以吸干余液。沉淀为初步纯化的细胞核。 加入TrisHClNaCl核洗液5ml洗涤沉淀，以2000r/min离心 10min，除去上层液。得到的白色沉淀即为纯化的肝细胞核。 加5ml 0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液，保留，待测定核 酸。 0.88 mol/L蔗糖- 柠檬酸溶液9ml核悬液0.25 mol/L0.88 mol/L初步纯化 的细胞核其它的亚 细胞结构半个肝脏1.5%柠檬酸溶液4.5ml，制成匀浆单层纱布过滤1次滤液 离心：3500r/min；15min上清液 （保留！）沉淀加入0.25mol/L 蔗糖柠檬酸溶液1ml 核悬液沿壁缓铺于9m
6、l 0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上 离心：2000r/min；10min上清液（弃去）沉淀核洗液5ml洗涤沉淀上层液（弃去）沉 淀纯化的细胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核 待测样品鉴定离心：2000r/min，10min细胞核的分离与纯化实验流程试剂试剂 （ml）12 细细胞质质液1.0-细细胞核液-1.0 1mol/LKOH1.01.02. 显色与比色：取试管三支，编号，按下表操作:试剂试剂 （ml）12空白管 细细胞质质RNA水解液1.0- 细细胞核RNA水解液-2.0- 5三氯氯醋酸1.02.0 3,5一二羟羟基甲苯液3.03.03.01. 水解：取试管二支，编号
7、，按下表操作：混合各管 沸水浴(10min) 冷却加入5%三氯醋 酸 (8ml) 搅匀后离心 2000r/min；5min上清液 立即混合各管 沸水浴(10min)冷却660nm比色测定二、RNA的定量测定试剂试剂 （ml）12 细细胞质质液2.0- 细胞核液-2.0 1mol/L过氯过氯 酸2.02.0试剂试剂 （ml）12空白 管 细细胞质质DNA水解液2.0- 细细胞核DNA水解液-2.0- 0.5mol/L过氯过氯 酸 2.0 二苯胺试剂试剂4.04.04.0混合各管冷却离心 上清液 立即混合各管冷却2000r/min;5min三、DNA的定量测定2. 显色与比色：取试管三支，编号，按
8、下表操作:1. 水解：取试管二支，编号，按下表操作：沸水浴(10min)沸水浴(12min)595nm比色测定表1. RNA的定量结果试管编号1（细胞质液 ）2（细胞核液 ） 原始吸光度值 查标准曲线所得数值 提取液中RNA浓度（ug/ml） RNA占总总RNA的百分比提取液中RNA浓度（ug/ml）=显色反应试管中RNA含量稀释倍数 （细胞质液稀释倍数为10倍，细胞核液的稀释倍数为5倍）表2. DNA的定量结果试管编号1（细胞质液 ）2（细胞核液 ） 原始吸光度值 提取液中DNA浓度（ug/ml） DNA占总总DNA的百分比1. 酸性溶液，取用要小心。2. 混匀要充分，并且要注意安全，防止液体溢出。3. 沸水浴操作时，要注意自己和别人的安全。4. 离心完后，一定先将上清液转出到另一试管，再吸取所需量的水解液。3. 除了定糖法来测定DNA和RNA的含量，还有已经学习过的哪种方法也可以用来测定DNA和RNA的含量？1. 为什么说本实验的题目不合适？2. 我们已经学习了电泳法来分离蛋白质，请问我们是否可以用这种方法来分离DNA、RNA？实验七 氨基酸的薄层分析下次实验预习内容
