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1、LOGO创新化学实验与研究基金资助项目答辩D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导 分离检测研究专业：化学工程与工艺导师：谢天尧 副教授报告人：韦昱 07306407LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究实验及 讨论研究方案 研究背景选题 意义 结论LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u选题意义 D-丝氨酸是哺乳动物脑内NMDA型谷氨酸受体 (NR1/NR2型)的辅助激动剂，在动物的大脑中一 生都维持着很高的浓度；脑内的神经元和胶质细 胞都含有D-丝氨酸并且具有特异的生物合成、胞 外释放、摄取和降解途径。 D-丝氨酸作为一种重要的胶质细胞递质，在中枢 神经系
2、统参与调节突触可塑性、感觉信息传递、 神经发育及神经兴奋性毒性等生理及病理过程, 并逐渐成为阿尔采末病(AD)等神经系统疾病新的 治疗靶点。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u研究背景 如何分离检测D-丝氨酸？ 针对其外消旋体的拆分已开发了优先结晶法、形 成非对映体立体异构体结晶法、酶促法、色谱法 （包括：液相色谱、气相色谱、薄层色谱、配位 色谱、离子交换色谱）毛细管电泳法和萃取法等 。 存在的问题： 丝氨酸由于其结构简单，分离难度较大，且没有 紫外或荧光吸收，常需衍生后才可得到检测。如何建立D-Ser有效检测的快速方法，大大降低检测成本 ，仍是分析工作者面临的具有挑战
3、性的课题。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u研究背景 高效毛细管电泳（HPCE）是一类以毛细管为 分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液 相分离分析技术，因具有低耗、快速、高效、 环境友好等特点而成为新兴的手性分离分析中 极具吸引力的分析方法。非接触电导检测是近 年来出现的新的检测技术，对于缺乏紫外-可见 吸收基团氨基酸则无须先作衍生化处理,可以进 行直接检测。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u研究方案 本课题提出采用高效毛细管电泳-非接触式 电导法，以铜-L-精氨酸作为配体交换选择 剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC）构成二 元手性选择体系
4、，建立快速、灵敏和低成本 的D-丝氨酸的分离分析新方法。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u分离分析原理 毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管 为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行 为上的差异而实现高效，快速的新型液相分离分析 技术；而非接触式电导检测器是近年发展起来的一 种新型电导检测方法。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u实验部分 仪器和试剂 手性选择体系的选择 最佳实验条件的确定 线性范围、重现性、检出限测定LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u仪器CES2008型毛细管电泳仪LOGO D-丝氨酸的毛
5、细管电泳-非接触式电导分离检测研究u实验试剂 氢氧化钠(NaOH，广州化学试剂厂，分析纯)、柠 檬酸(Cit，广州化学试剂厂，分析纯)、乙酸铜 (Cu(CH3COO)2H2O，天津市科密欧化学试剂开发 中心，分析纯)、羟丙基甲基纤维素(HPMC，山东 赫达股份有限公司，分析纯)、D,L-丝氨酸、L-丝氨 酸(D,L-Ser、L-Ser，国药集团化学试剂有限公司， 层析纯)、L-精氨酸(L-Arg，上海伯奥生物科技有限 公司，层析纯)。所用水为超纯水。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u手性选择体系的选择仅用Cu()丝氨酸对映体未 能达到分离Cu()+ L-Arg分离度R
6、s=1.6Cu()-L-Arg +HPMC分离度Rs=2.1LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u手性选择体系的选择图1 两种不同的手性选择体系对分离度的影响 Fig. 1 The effect of two different chiral selectors on the resolutiona.Cu()-L-Arg b. Cu()-L-Arg-HPMCLOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u铜离子浓度对分离度的影响图2 Cu()浓度对分离度的影响 Fig.2 The effect of Cu() concentration on the reso
7、lution 本实验选择Cu()的最佳浓度为2.5mmol/L。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究uL-精氨酸浓度对分离度的影响图3 L-精氨酸浓度对分离度的影响 Fig.3 The effect of L-Arg concentration on the resolution 本实验选择L-精氨酸的最佳浓度为5.0 mmol/L。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究uHPMC浓度对分离度的影响图4 HPMC浓度对分离度的影响 Fig.4 The effect of HPMC concentration on the resolution 因此，本
8、实验选择HPMC最佳浓度为10 mg/L。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响 NaOH-Cit体系在非接触电导检测法中有良好的基线和灵 敏的响应，但缓冲溶液浓度太高易引起基线漂移。通过实 验发现，柠檬酸浓度对对映体分离的影响很大，浓度太低 ，丝氨酸不出峰；浓度太高，水峰提前，对映体也得不到 分离，见下表。 表1 柠檬酸浓度对分离度的影响 故实验选择Cit浓度为0.4 mmol/L。CCit (mmol/L)0.20.40.60.81.0Resolution (Rs)-2.31.8-LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研
9、究u缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响 固定柠檬酸浓度后，加入NaOH以调节运行液的pH。在24 mmol/L浓度范围内考察NaOH浓度对分离度的影响，见表2。表2 NaOH浓度对分离度的影响故实验选择NaOH浓度为3.0 mmol/L。CNaOH (mmol/L)2.02.43.03.44.0Resolution (Rs)0.91.62.41.91.9LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响 图5 pH对分离度的影响 Fig.5 The effect of pH on the resolutionLOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导
10、分离检测研究1电动进样对离子组分存在 进样歧视2重力进样无进样歧视3扩散进样进样具双向性， 有进样歧视u进样方式的选择故本实验采用重力进样。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u进样方式的选择图6 进样时间对分离度的影响 Fig.6 The effect of injection time on the resolution 进样时间为60s时分离度最高，Rs=2.6。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u进样方式的选择 此外，进样时间还对峰高及峰面积有较大影响，见表3。 表3 进样时间的影响故实验选择Cit浓度为0.4 mmol/L。进样时间 （s
11、）304050607080100120峰 高L- Ser4955748410010513964D- Ser51689210912212917082峰 面 积L- Ser10611460211926832916296245701444D- Ser11021683268833843354346850651850LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u分离电压的选择 本实验考察了分离电压从10kV至15kV对丝氨酸对映体分离的 影响，见表4。表4 分离电压对迁移时间和分离度的影响故实验选择Cit浓度为0.4 mmol/L。working voltage (kV)101213141
12、5Resolution (Rs)2.62.32.01.81.6Migrating time of D- Ser(min)48.832.726.523.521.8LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究运行液体系： 3.0 mmol/L NaOH+0.4 mmol/L Cit +2.5 mmol/L Cu(Ac)2+5.0 mmol/L L-Arg +10.0 mg/L HPMC（pH=9.67）重力进样，进样时间为60s分离电压为13kV最佳实验条件LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u线性范围与检出限图7 D-丝氨酸线性校正曲线图 表5 线性范围与检出
13、限 待测组分回归方程相关系数线性范围 （mg/L）检出限（ mg/L） D-丝氨酸y=-123.8+ 981.9xr= 0.99991100 0.5LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u重现性测定 在相同条件下，D-Ser以3 mg/L的浓度重复进样4次，测其重 现性，见表6。表6 重现性测定结果表明：实验证明本方法具有较高的灵敏度和良 好的重现性。序号1234RSD/%迁移时间 （min）23.124.722.623.33.9峰面积24002473261626805.0LOGOu实际样品分析图8 D-丝氨酸小鼠脊髓样品HPCE-C4D谱图 Fig.8 The elect
14、ropherogram of D-Ser in rat spinal cord D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u拆分机理初步探讨 在缓冲溶液中，铜离子与L-精氨酸以12形成三元 络合物： L-Arg+Cu()(L-Arg)Cu L-Arg+(L-Arg)Cu()Cu(L-Arg)2 当丝氨酸对映体进入缓冲系统时，D-Ser和L-Ser分 别取代一分子的L-Arg,形成两种不同的三元络合物: L-Ser+Cu(L-Arg)2(L-Arg)Cu(L-Ser)+ L-Arg D-Ser+Cu(L-Arg)2(L-Arg)Cu
15、(D-Ser)+ L-ArgLOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u拆分机理初步探讨 根据(L-Arg)Cu(L-Ser)和(L-Arg)Cu(D-Ser)稳定性和 光学结构的差异，引起二者电泳淌度的不同，D,L- Ser得到分离，本实验中L-Ser比D-Ser先流出。 由于(L-Arg)Cu(L-Ser)和(L-Arg)Cu(D-Ser)的稳定性 系数差异不够大，丝氨酸对映体分离度较小。缓冲 溶液中加入HPMC后，HPMC与Cu()-L-Arg形成 二元手性选择体系，D,L-Ser分离度提高。LOGO D-丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分离检测研究u结论从实验结果可以看出，本实验提出的采用高效 毛细管电泳-非接触式电导法，以铜-L-精氨酸作为 配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（HPMC） 构成二元手性选择体系分离检测D-丝氨酸的新方法 ，高效简便、环境友好、成本低、检出限低，可用 于实际样品的分析应用。 LOGO感谢中山大学化学院创新研究基金的资助！感谢谢天尧老师的悉心指导 ！感谢袁秋月师姐对本实验给予的耐心的指导和 帮助！报告人：07化工 韦昱
