《聚合酶链式反应-2011分子生物学》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚合酶链式反应-2011分子生物学（108页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第三章 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR ）聚合酶链反应 又又称体外体外DNADNA扩增技术。是指利用耐热扩增技术。是指利用耐热 DNADNA聚合酶的反复作用，通过变性聚合酶的反复作用，通过变性- -退火退火- -延伸循环操作，在体外延伸循环操作，在体外特异特异地扩增所需要地扩增所需要 的的DNADNA片段的一种技术。它能片段的一种技术。它能快速快速将将皮克 (pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右 ，达到微克(g)水平。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重优点：敏感度高、特异性强、产率高、重 复性好以及快速简便等。复性好以及快速简便等。在分子
2、生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。并已普及到许多普通实验室，大大简化了并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，便于对传统的分子克隆技术，便于对目的基因目的基因进行分析、鉴定。进行分析、鉴定。目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取DNADNA分子分子通常的通常的DNA DNA 扩增法是分子克隆法扩增法是分子克隆法, , 首先要构建含有目的的基因的载体首先要构建含有目的的基因的载体, , 然然后将它导入细胞后进行扩增后将它导入细胞后进行扩增, ,还要用同还要用同位索探针进行筛选位索探针进行筛选;
3、;要经过要经过DNADNA内切、连内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复接、转化和培养等相关的过程，操作复杂杂, ,一般需要数周时间。一般需要数周时间。 70年代的初期由Dr. H. Klenow发现了较具有实验价 值及实用性的Klenow fragment of E. Coli ； 1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分 离出来的Taq polymerase ，它的特性能耐高温。 80 年代之后它被广泛运用； 1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法； 1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值的 PCR技术； 1987年引入了耐高温的
4、DNA聚合酶，从而使PCR成 为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。 1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。PCR技术的发现Kary B Mullis (1944-)l 1983 年提出PCR方法l 1993年度诺贝尔化学奖一、PCR基本原理 PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。 依据DNA半保留复制的机理。 PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。第一节 PCR技术的原理和特点细胞内复制的过程1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3-OH末端。3）DNA聚合酶以亲代DNA
5、单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引物的3端，循53方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA双链。Denaturing 95CAnnealing Tm-5CExtension 72CPCR的原理PCR的基本过程1.变性：将反应体系升温至95左右，样品 中双链DNA解开成两条单链，各自作为模 板（待拷贝的 DNA 称为模板） 。2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55 左右)，5端和3端的引物各自与两条单链 DNA模板的互补区域结合。5533编码链3端引物5端引物3 33. 延伸：将温度升到75左右，耐热的 Taq DNA聚合酶催化四种 dNTP，从引 物3-OH端开始，
6、依据模板碱基序列互 补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链。55335DNA聚合酶5Cycle 35555 5555 555555 552530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCRPCR产物的鉴定、提取产物的鉴定、提取PCR的扩增效应 理论上，每增加1个循环，双链DNA片 段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n)增加。 实际上，扩增效应低于指数增加，约为 (1+X)n。 一般进行30个左右的循环，特定区域的 DNA量可至少增加 106 倍。PCR产物的积累规律 PCR反应初期，目的DNA片段的增加 呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累
7、，酶的催化反应趋于饱和， 此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出 现“平台效应”。 到达平台期所需要的循环次数一般在30次循环之后。PCR DNA复制部位： DNA体外合成放大过程 生物体内DNA合成引物： DNA引物 RNA引物（作为新链的一部分） （复制终止时被切除 ）催化酶：TaqDNA聚合酶 DNA聚合酶有5 3核酸外切酶 有5 3核酸外切 酶无3 5核酸外切酶 有3 5核酸外切 酶基本过程：每循环一次包括 复制起始、链延伸 和变性、退火、延伸 终止三阶段反应实质：扩增靶DNA 合成子代DNAPCR仪聚合酶链反应中的变性、退火、延伸的温度和时间，以及循环次数，是由具有程控的快速升温和快速降
8、温装置的PCR仪控制。PCR仪越快，越精确，越昂贵ABI 7500实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪二、PCR技术的特点1. 高度的敏感性：可将极微量(pg)DNA ，扩增到紫外光可见的水平(ug)，这是最主要的特点，它可对单拷贝基因 、单个细胞、单根头发、一滴血等微 量标本进行分析。2. 高度的特异性：PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定，因此引物设计至关重要。 引物与模板DNA特异正确的结合；遵循碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。引物引物引物引物引物的序列及其与模板结合的特异性是决引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定定PCRPCR反应结果
9、的关键。反应结果的关键。引物设计的原则是最大限度地提高扩增效引物设计的原则是最大限度地提高扩增效 率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增 。基因 组3. 适用样品的广泛性： 对样品的要求并 不十分严格：1)可以是DNA，也可以是RNA2)可以是纯化的，也可以是粗制的3)可以是新鲜组织，也可以是陈旧组 织4)可以是细胞，也可以是体液4. 操作简便、快速：PCR自动化，数小 时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一 定要用同位素，无放射性污染、易推广。 三、参与PCR反应体系的因素及其作用 模板 引物 Taq DNA聚合 酶 dNTP Mg2+ 缓冲液 反应温度
10、循环次数 PCR仪等n PCR体系（一）模板核酸 1. 模板：指能扩增靶DNA片段的核酸 2. DNA是直接模板，RNA是间接模板RNA样品必须先经过逆转录生成cDNA， cDNA作为PCR扩增的模板。这个技术称为逆转录 PCR（RT-PCR）。 病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺 旋体、立克次体、支原体等。 病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、 羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养 细胞系。 法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。 考古标本：残留有核酸物质3. 常见的扩增对象(含核酸的标本)：4.避免有影响扩增反应的物质存在如：核酸酶：降解DNA、RAN蛋白酶：降解Taq DNA聚合酶血红素、抗凝剂
11、：抑制Taq DNA聚合 酶活性理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板。 人基因组组DNA0.1-1 g大肠肠杆菌基因组组DNA10-100 ngDNA0.5-5 ng质质粒DNA0.1-10 ng5. 模板量要合适，一般为102105拷贝。50l PCR反应体系中模板DNA推荐使用量 （二）引 物1）引物：2条人工合成的、能与模板DNA互补结合的脱氧寡核苷酸。1. 引物的性质和作用2）引物的序列：根据欲扩增的DNA片段两端序列而设计的。5端引物：与模板链的5端序列相同；3端引物：与模板链的3端序列互补。5533模板链3端引物5端引物3 33)
12、 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。4) 引物设计决定PCR反应的成败。特异性：引物只针对DNA的一个特定序列 互补结合，因此2条引物与DNA模板 特异性结合决定了要扩增的DNA区 域。 长度：2条引物分别互补于所要扩增DNA 片段的两端，使DNA片段的扩增只 限于引物之间的部位。2. 引物设计的基本要求1）引物长度要合适，一般为1630个 核苷酸，常用20bp左右。 引物过短：会影响PCR的特异性； 引物过长：需提高相应的退火温度，若 超过延伸温度即Taq DNA酶的最适温度，则影响PCR反应产物。2）G+C含量一般占5060，有利于引 物与模板的结合。G C太少扩增效果不佳 ，G C过
13、多易出现非特异条带。3） ATCG 4 种碱基随机分布，避免连续出 现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成 串排列，最好随机分布。否则易使引物与 模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。4）引物内部不能存在互补序列，以避免形 成发夹结构。 5）两个引物之间不能存在互补序列，以避 免形成引物二聚体。6）引物与非特异性序列的同源性不能超过70% 或不能有连续8个碱基互补，否则导致非特异性扩增。7）引物3末端碱基一定要与模板正确配对，引 物3端最佳碱基选择是G和C。8）引物的5端可以修饰，如：引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等9）引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条 件下可扩增长至
14、10kb的片段。 55限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变探针标记探针标记引物引物33端端为为关键碱基关键碱基；55端端无严格限制。无严格限制。33355GC3.引物的使用要求 引物浓度要远高于模板浓度，一般每条引物的浓度0.1 0.5 mol，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 合适的退火温度比引物本身的Tm低 5 ，一般在 55 左右。（三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株(一种嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长2.49kb，编码832
15、个氨基酸。该酶虽然在90以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性。（天然酶）另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶）Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。(一)酶活性与热稳定性1）酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000/mg，Taq酶的浓度通常为12.5/l，太多浪费并易导致非特异性扩增。2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。 1）Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对Mg2+ 浓度非常敏感。2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。3）Mg2+ 能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+ 浓度，优化浓度一般反应
