《细胞工程与食品产业》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞工程与食品产业（172页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、广东药学院食品科学学院食品生物技术课件 E-mail:z_c_ 手机:18924921189郑 传 进第六章 细细胞工程与食品产业产业 主要内容n 细细胞工程的概概念、研研究范畴畴 n 植物细细胞培养养 n 动动物细细胞培养养 n 细细胞融合技术术 n 细细胞拆合技术术第一节节、概述利用细胞生物学和分子生物学技术， 应用工程学的方法，在细胞水平上研究改造 生物遗传特性和生物学特性，从而获得特定 的细胞、细胞产品或新生物品种的一门综合 性科学技术。概念1 细细胞工程的概念及研究范畴研究范畴动物细胞与组织培养 植物细胞与组织培养 细胞融合 细胞核移植（细胞拆合） 染色体工程 胚胎工程 干细胞与组织
2、工程 细胞生物反应器1）植物细胞和组织培养技术2）动物细胞和组织培养技术 3）细胞融合技术（ 体细胞杂交技术） 4） 细胞拆合核移植技术5）染色体工程技术染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体从而定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。主要分为动物染色体工程和植物染色体工程6）胚胎工程技术7）干细胞和组织工程8）细胞培养生物反应器2、植物细细胞工程的应应用紫杉醇(taxol)是从红 豆杉属(Taxus L.)植物中 分离出的一个具有独特抗 肿瘤活性的二萜类化合物 ，现已应用于临床治疗卵 巢癌和乳腺癌。三、动动物细细胞工程的应应用1.在疫苗生产产上的应应用 。将乙型肝炎表面抗原基
3、因插入哺乳动动物细细胞内 进进行高效表达，已生产产出乙型肝炎疫苗。2. 生产产单单克隆抗体 单单克隆抗体可以检测检测出多种病毒中非常细细微的 株间间差异，鉴鉴定细细菌的种型和亚亚种。 3.繁育优优良品种。目前，人工受精、胚胎移植等技术术已广泛应应用 于畜牧业业生产产。 4. 在干扰扰素生产产上的应应用 是指动动物、植物和微生物细细胞在体外无菌条件下的生长长、分裂和繁殖，并在培养过过程中不再形成组织组织 的一项项技术术。细胞培养第二节节、植物细细胞培养技术术一、 植物细细胞工程的发发展细胞学说的创立：18381839年间由 德国的植物学家施莱登（Schleiden）和动 物学家施旺（Schwan
4、n）所提出,直到1858 年才较完善。 理论基础和探索1902年，德国著名植物生理学家 Haberlandt, 提出细胞全能性学说， 并首次进行高等植物的细胞培养实验 ，但细胞未能发生细胞分裂和增殖。1756年，Moncean首先发现植物 在受伤愈合的组织皮层能产生芽， 因而预言这一途径可以成为一种繁 殖方式培养技术建立植物细胞培养技术应用发展20世纪40年代：J.Bonner 银胶菊组织培养生产橡胶。20世纪70年代：植物细胞培养生产药用成份。20世纪80年代：400多种植物，600多种代谢产物。40多种植物次生代谢产物达到或超过植株产量。20世纪90年代：1000多种植物。1.首先，要取材
5、和除菌。用一定的化学试剂对材料进行严格的表面清洗、消毒。有时还要借助某 些特定的酶，对材料进行预处理，以期得到分散生 长的细胞。常用的消毒灭菌剂:效果较好的有几种化学试剂 ，如次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞等。二、细细胞培养一般步骤骤2.其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作技术，将生物材料接种于培养基中。3. 最后，将接种后的培养基放入培养室或培养箱中，提供各类细胞生长所需的最佳培养条件。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。 三.植物细细胞培养基植物细胞的培养基:通常包括无机盐、碳源 、维生素、生长调节素、有机添加剂等。用于植物细胞培养的基础培养基营养
6、成分 基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养 细胞、组织和器官的培养基要满足各自特殊的 要求无机盐：有不少盐可用来提供“大量元素” 和“微量元素”，表中给出了常用培养基中无 机盐的含量。培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖都能利用， 果糖的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅 速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用 ，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源 ，但效果不佳。碳源和能源培养中的植物细胞都需要硫胺素，加入烟酸、泛酸、生物素和叶酸，效果更好。原生 质体培养通常需要大多数必需维生素。维维生素虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需 的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物 是很有好处的。此外，还
7、使用蛋白酶解产物，如酪 蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有机添加剂还有如 乳蛋白水解物，酵母提取物等氨基酸激素分为两类，生长素和分裂素。生长素促进 细胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸 ；分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。 使用最多的是6-苄氨基嘌呤和玉米素，对芽的诱导 具有重要作用。分裂素和生长素通常一起使用，来 促进细胞的分裂、生长。植物生长长激素四.愈伤组织伤组织 和悬悬浮细细胞培养技 术术 愈伤组织：是指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的，而且还未形成组织的结构。外植体：是指植物组织培养中用来进行离体培养的植物材料。愈伤组织的诱导选择适宜的
8、外植体：幼胚、下胚轴、子叶 选择适宜的培养基：MS，B5，N6 较高激素浓度 丰富的有机附加物。培养基中有较高含量的无机氮源较低的蔗糖浓度 适当缩短继代培养的间隔时间有利于疏松易 碎愈伤组织的形成。要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色 泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎适宜悬悬浮培养适宜再生植株悬浮系的建立与培养callus150250ml flaskcentrifuge isolationsubculture1g/10ml medium100120 rmp culture transfer 1 time/3d80 rpm高表达细胞系的筛选建立一是悬浮培养物分散性好，
9、外观疏松、色泽鲜艳二是均一性好三是生长速度快、次生代谢产物合成能力强五.单细单细 胞培养技术术机械法将叶肉组织研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。优点：不受酶的伤害，有利于细胞生理和生化研究。缺点：手工操作难度大，获得完整的细胞数量少。1、单细胞分离方法酶法利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植物体，使细胞分离。加渗透压保护剂如甘露醇以防酶对细胞的损伤。加硫酸葡聚糖钾盐可提高游离细胞的产量。化学法利用利用化学药剂使细胞分离的方法。草酸钙处理胡萝卜悬浮细胞培养物时，可获得分散细胞。秋水仙碱、2，4D或LH。看护培养2、单细胞培养方法用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。
10、优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。将悬浮单细胞与融化的琼脂培养基均匀混 合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。平板培养平板培养平板培养植板率优点： 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显镜下对细胞进行定点观察。筛选效率高、筛选量大、操作简便。缺点： 通气状况不好，排泄物质易积累造成 毒害或影响组织吸收。微室培养在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。置培养皿中2628 恒温培养优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程。缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分
11、裂。六.提高植物细细胞次级级代谢产谢产 物含量的方法加入前体物或诱导物前体物：次生代谢合成途径中的某一中间化合物或是合成的起始物。诱导物：一类能引起植物细胞代谢强度变化或代谢途径改变的物质。毛状根培养毛状根(hairy roots)是发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物后，其Ri质粒上的TDNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。 冠瘿瘤培养植物细胞大规模培养在食品工业中的应用（1）利用植物细胞工程生产香料（2）生产食品添加剂（3）生产天然食品七、植物细细胞大规规模培养植物细胞大规模培养的特点植物细胞对剪切力敏感。 植物细胞培养通常形成细胞团
12、。 植物细胞生长速度慢，操作周期长 多泡沫。 植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。 植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。 大多数植物细胞培养需要光照。几种流体特征1-宾汉 型 2-假塑性 3-牛顿型 4-涨塑性 1-涨塑性 2-牛顿型 3-假塑 性 1.植物细细胞悬悬浮细细胞培养悬浮细胞培养技术悬浮培养优势把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行增殖培养1）培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。2）可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部 浓度过高的问题。3）能充分保证氧的供给。2.植物细细胞固定化培养植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。固定
13、化培养技术（1）有利于次生物质的合成、积累；（2）减弱剪切力损伤；（3）有利于连续培养和产物的收集；固定化培养优势1）悬浮培养生物反应器植物细胞大规模培养的初期（20世纪70年代），主要采用微生物培养用的机械搅拌反应器。1972年，Kato首先用机械搅拌反应器培养烟草细胞以获取烟碱。Fujita利用这种反应器生产紫草宁。3.植物细细胞培养生物反应应器机械搅拌反应器机械搅拌植物细胞反应器机械搅拌反应器的优点及存在的问题优点：机械搅拌生物反应器最大的优点就是获得高的溶氧系数 (KLa 100h-1)，植物细胞培养一般只需要KLa在5-20 h-1之间就够了；再是反应器的温度、pH值、溶氧及营养物质
14、的浓度较易控制。存在的问题：主要问题是剪切力问题；对只需较低kLa的植物细胞培养，促进氧传递的机械搅拌，每单位体积消耗的功率比气体搅拌要大；机械搅拌需搅拌轴，由此又带来了无菌密封问题。非机械搅拌反应器通常为气体搅拌反应器，是一种利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有鼓泡式反应器和气升式反应器，气升式反应器又可分为外循环和内循环式。我国的刘大陆、查丽杭等发明了“气升内错流式”植物细胞培养反应器用于培养紫草，紫草宁含量达到了干细胞重的10%，是天然植株的2-8倍。气体搅拌反应器的优点及存在的问题优点：剪切力小，对植物细胞损伤小；因没有搅拌轴而更易保持无菌；操作费用低。不足：因气体搅拌强度低
15、，高密度培养时混合不够均匀。靠大量的通气输入动量和能量，以保证反应器内培养液的良好传质、传热。但过量的通气易排除培养液中的二氧化碳和乙烯，对于细胞生长有阻碍作用。再是过高的溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利。2)固定化细胞生物反应器固定化细胞：将一定生理功能的生物体用物理或化学方法使其与适当载体相结合，作为固体催化剂利用。优点：单位体积细胞多，受剪切力小。缺点：由于其混合效果低，对必要的氧 传递，pH值、温度控制和气体产物(如C02)的排除造成了困难。再者支持物颗粒破碎易堵塞填充床。填充床反应器Jones 在填充床反应器中进行了固定化胡萝卜的培养，Kargi 采用这种反应器培养长春花流化床反应
16、器优点：良好的传质特性。缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞，同时，流体动力学的复杂性使之难以放大。 典型的流化床反应器是利用液体或气体的流动使支持物颗粒处于悬浮状态。Hamilton 用之培养胡萝卜细胞，研究了转化酶活性。膜反应器优点：可以重复使用。另外，流体易控制，易放大，而且能提供更均匀的环境条件。膜具有选择性，有利于产品分离。缺点是构建膜反应器的成本较高。第三节节、动动物细细胞培养技术术19世纪30年代，Muller, Schwann, Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹 等病理组织中观察到多核细胞现象。1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象 的存在，1855年1858年，科学家们在肺组织 和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多 核细胞。 1融合现现象的发现发现一、动动物物细细胞工程的发发展1859年，A. Barli在研究黏虫的生活史时发 现，某些黏虫存在着由单个核细胞融合形成多 核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞 是由单个细胞彼此融
