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1、多位点可变数目串联重复序列（ MLVA）分型技术和操作步骤李 伟中国CDC 传染病所 传染病预防控制国家重点实验室 PulseNet China第一期培训 2010-06-191病原菌分子分型的目的 长期研究病原菌的遗传进化 病原菌适应来自宿主的高选择性压力 因点突变、重组（包括基因转移）等遗传变异 短期研究 了解病原菌的适应性 感染溯源2分子分型方法 序列或分类资料为基础的等位基因： 多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST ） 多位点可变数目串联重复序列分析（Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat An
2、alysis,MLVA） 图像分析： 脉冲场凝胶电泳（PFGE) 随机扩增多态性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD) 扩增片断长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism, AFLP） 核糖体分型（ribotyping） 等3MLST 结果无偏性unambiguous results 有相应的数据库支持 international databases 区分度低，Low discrimination power 高花费，high cost: sequencing 不适合常规检测和暴发调查，unsu
3、itable for routine surveillance and epidemiological studies4VNTR VNTR：可变数目出那里重复序列， Variable Number of Tandem Repeats AACTTTACGTTCAAATTAACGTTCAAATTAACGTTCAAATTTACCTTG侧 翼 序 列重复单元518bp*3 AACCTAAACAGACCATGGCGCTGGGC TGCTGGAGCGAGCAGGAGCTGGTGG GCGAGCAGGAGCTGGTGGGCGAGCA GGAGCTGGTGGGCGAGCAGGGAVNTR产生的原因：聚合酶的滑
4、链复制6100 bp200 bp300 bpGel migrationStrain CDC1551: 5 x 15 bpStrain H37Rv: 4 x 15 bpstrain CDC1551 : 230 bpstrain H37Rv : 215 bp230 bp215 bp200 bpPCR primers:CTCCCACACCCAGGACAC CGGCCTACCCAACATTCCPCR215 bp230 bpTRF 软件（Tandem Repeats Finder software），:/minisatellites.u-psud.fr/VNTR 位点的确定测序分析7VNTR和等位基因a
5、tgggtaatccgtcgACGCACGCACGCgccaatcgatacgatPrimer-F上游序列VNTR 重复下游序列重复拷贝数 =扩增大小-上下游序列 重复单元的大小Primer-R取整：就近取整或去除小数取整8串联重复序列可变重复数目的判定9MLVA方法 多位点可变数目串联重复序列分析 可变数目串联重复：VNTR： MLVA方法：即VNTR的数组 例如：MLVA1型 735 2 6 6 2 10 2 3 3 1 36 ST1 + + - MLVA1型别 菌株 血清型 TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 TR7 TR8 TR9 MLST 其他特征MLVA14 1046
6、15 3 1.7 1 9 1 2 3 0 26 ST81 - - -10分析软件：BioNumerics 命名MLVA型：MT1-MT85 评价各位点的分辨力： Neis index = 1- (allele frequency)2 评价MLVA方法的分辨力： Simpsons index = 1 - nj (nj-1)/N (N-1) 聚类分析 构建最小生成树11MLVA 实验操作一、模板制备：DNA提取模板或水煮模板二、PCR 扩增 多重PCR反应三、扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物（FAM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI
7、 3730系统进行分析， 用内标（ABI自带） （二）普通电泳分析（三）测序分析12MLVA实验步骤-PCR2个PCR体系/多重PCR体系：体系（ 20ul）指标Buff erdNTP上下游引 物 10uM（个 ul）酶模板ulTm延伸时 间循环 数片段大小 判断方式A1TR2-FAM2.01.50.20.3u0.75640秒30毛细管电泳 TR4-HEX0.3 A2TR1- FAM2.01.50.20.3u0.75740秒30毛细管电泳 TR3-HEX0.3模板制备： DNA提取模板 水煮模板13扩增条带大小判断： （一）毛细管电泳： 1.引物标记 2. 多种不同的荧光染料标记上游引物 （F
8、AM 、HEX 和TAMRA ） 3. ABI 3730系统进行分析， 用内标（ ABI自带） （二）普通电泳分析 （三）测序分析14用500liz内标标定扩增片段大小用 genemap软件分析毛细管电泳图用毛细管电泳来判断片段大小15MLVA聚类分析 Bionumerics 软件（version 4.64 ） 效用均等的分类资料的分析方法（ UPGMA） (unweighted pair group method using arithmetic averages) 等分权重 分类图/最小生成树的形式展现 多态性指数： Simpsons index 16MLVA方法的应用Neisseria
9、meningitidis(23) Streptococcus pneumoniae(20), Streptococcus uberis(12), Salmonella Enteritidis(10), Salmonella enterica(5,35), Listeria monocytogenes(28,29,39), Legionella pneumophila(33), Clostridium perfringens(37), Leptospira interrogan(38,38), Escherichia coli O157:H7(30,46), Clostridium diffic
10、ile(43), Burkholderia pseudomallei(42), Pseudomonas aeruginosa(32), Shigella spp(13) et.al. 17分型方法评价标准 区分度(discriminatory power) 数字化数据库 适合实验室间比对（compare between laboratories） 重复性（Reproducible） 流行病学相关性（epidemiological concordance） 方便快速（convenience and rapidity ） 稳定性（stability） 容易解释（easy to interpret）
11、 花费 技术难度18MLVA方法的好处 上述的优点 具有弹性 flexibility. 不需要参考菌株作为参照19第二部分发展一种新的MLVA方法20基于序列的比较初筛多态性VNTR位点的 PCR鉴定和筛选核酸测序 确定重复模式区分效能评价系统测试筛选多态性VNTR得分大于70，拷贝数大于3，同源性大于75% 选择出114位点现实的模板扩筛选 33血清型和21个猪链球菌2型 36个电泳行为不同确认重复序列和重复单元数 14个确定指标9个指标的MLVA策略21TRF 软件 （Tandem Repeats Finder software）:/minisatellites.u-psud.fr/串联重
12、复的鉴定匹配赋2分 不匹配-3分 碱基缺失-5分 最小报告分值50分以猪链球菌为例： 鉴定了750,749,790,784 测序菌株基因组串联重复位点的比较菌株名称血清型来源ST 型GZ12(CP000837)ST1P1/72(www.sanger.ac.u k)ST105ZYH332(NC_009442)ST798HAH122(NC_009443)ST7SC842ST722串联重复的鉴定23串联重复的鉴定IndicesPeriod Size Copy NumberConsensus SizePercent MatchesPercent IndelsScoreACGTEntropy (0-2)
13、1858865-1858900123.0127005236533251.791862974-1863158463.946784228222312401.891867321-1867363162.61670752252513341.9324串联重复的鉴定2526inserted a small segment泳道1234567891011121314菌号SC22NJ2598029801GZ189-1591P1/7R735ATCC4376511611HASS-73SC061001SC0623806GZ115161718192021222324LN1GX2CQ1GZ2SC17SC8443800324
14、380026RC4716Gx4072728多种重复模式IndicesPeriod Size Copy NumberConsensus SizePercent MatchesPercent IndelsScoreACGTEntropy (0-2) 217182-217298244.524611896271635211.94 217182-217291158.114571877271735201.94 217221-217313392.439941171251634231.95 217185-217309129.712581487271634211.95TR229第三部分MLVA方法在猪链球菌分型
15、中的应用30猪链球菌暴发疫情 2005年-四川人感染猪 链球菌暴发疫情 215人感染、39人死亡 波及四川36个县的202 个村庄 重庆， 贵州， 广东， 江西也发现病例 江苏 1998暴发疫情 25 感染/14 死亡Yu, H., H. Jing, Z. Chen, et al. 2006. Human Streptococcus suis outbreak, 四川, China.Emerg.Infect.Dis. 12:914-92031中国猪链球菌PFGE型别 SmaI酶切：ST7型分为单一的PFGE-01型 2005，2006年和2007年中国ST7菌株： PFGE-01型Ye, et al. 2006. Emerg.Infect.Dis.32cod eLocusLocation in GZ1Matches In GZ1 %Tandem repeat sequenceTmSimpson s i
