多肽与蛋白质类药物

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1、 第十三章 多肽与蛋白质类药物第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法一、蛋白质类药物的分离与纯化 （一）材料选择蛋白质类药物的原料来源有动植物组织和微生物等 ，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获 得和易于提取的无害生物材料。对天然蛋白质类药物，为提高质量、产量和降低生 产成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源 、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定 的要求，了解这可使分离纯化工作事半功倍。（1）种属 牛胰含胰岛素单位比猪胰高，牛为4000IU kg胰脏，猪为3000IUkg胰脏。抗原性猪比牛的低 。前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而 牛有3个氨基酸的差异。（2）

2、发育生长阶段 幼年动物的胸腺比较发达，老龄 后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物。HCG在妊娠妇女6070天的尿中达到高峰；到妊 娠18周已降到最低水平。然而HMC必须从绝经期的妇 女尿中获取。肝细胞生长因子是从肝细胞分化最旺盛阶段的胎 儿、胎猪或胎牛肝中获得的。若用成年动物，必须经 过肝脏部分切除手术后，才能获得富含肝细胞生长因 子的原料。（3）生物状态 动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含 量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使 胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫血 症患者尿中的EPO含量增加。（4）原料来源 血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚 下腺中提取，而稳定性以颚下腺来

3、源为好，因其不含 蛋白水解酶。（5）原料解剖学部位 猪胰脏中，胰尾部分含激素 较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提 高各产品的收率。胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶则以采取胃 底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化腺。（6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑 到后处理的问题。大肠杆菌表达，由于其不能将所表 达的蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁，增加了 提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子。 用枯草杆菌或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛 盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修 饰的缺陷；用动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后 处理及

4、完整表达的问题。用肿瘤细胞作宿主细胞制成的医药产品还应考虑 到其安全性问题。（二）蛋白质提纯的一般方法根据蛋白质在溶液中的下列性质分离蛋白质：分 子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对其他分子的 生物亲和力等。1、根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质蛋白质、多肽及氨基酸都是两性电解质，在一定 pH环境中，某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势 相等，或解离成两性离子，其净电荷为零，此时环 境的pH值即为该蛋白质的等电点。在等电点时蛋白 质性质比较稳定，其物理性质如导电性、溶解度、 粘度、渗透压等皆最小，因此可利用蛋白质等电点 时溶解度最小的特性来制备或沉淀蛋白质。两性物质的等电点会因条件不同（如在不同离

5、子 强度的不同缓冲溶液中，或含有一定的有机溶媒的 溶液中）而改变。当盐存在时，蛋白质若结合了较 多的阳离子，则等电点向较高的pH值偏移。反之， 蛋白质若结合较多的阴离子，则等电点移向较低的 pH值。用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作，而除 去不需要的杂蛋白时，常需配合热变性操作。等电聚焦电泳除了用于分离蛋白质外，也可用于 测定蛋白质的等电点。 2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质蛋白质的一个主要特点是分子大。由此可以用凝胶 过滤法、超滤法、离心法及透析法等将蛋白质与其他 小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。注意 用超滤法时，超滤膜截留分子量常与实际情 况不一致。分子量相近的

6、蛋白质由于在介质中有呈线 形溶质或者是球形溶质的区别，可能出现不同的结果 。葡聚糖凝胶含有少量的酸性基团，故有较弱的离子 交换作用，此外还有吸附作用。在纯化蛋白质时，可 采用低浓度的盐溶液（0.01molL），或者用与待分 离蛋白质相同的标准蛋白质预先使凝胶柱平衡，以期 不损失所分离的蛋白质。3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋自质蛋白质的溶解度受溶液的pH、离子强度、溶剂的 电解质性质及温度等多种因素的影响。在同一特定条 件下，不同蛋白质有不同的溶解度，适当改变外界条 件，可以有选择地控制某一种蛋白质的溶解度，达到 分离的目的。属于这一类的分离方法有蛋白质的盐溶与盐析法、 结晶法和低温有机溶剂

7、沉淀法。乙醇和丙酮是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶 剂，由于丙酮的介电常数小于乙醇，故丙酮沉淀能力 比乙醇强。4、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质离子交换剂作为一种固定相，本身具有正离子或负 离子基团，它对溶液中不同的带电物质呈现不同的亲 和力，从而使这些物质分离提纯。蛋白质、多肽或氨基酸具有能够离子化的基团。对 蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架 的离子交换剂。主要是取其有较大的蛋白质吸附容量 、较高的流速和分辨率等优点。对已知等电点的物质，在pH高于其等电点时，用阴 离子交换剂，在低于其等电点时，用阳离子交换剂。5、根据蛋白质

8、功能专一性的不同来纯化蛋白质 主要的手段是亲和层析法，即利用蛋白质分子能与 其相应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合而 达到纯化的目的。注意 非专一性吸附主要来自吸附剂上的离子基团 和疏水基团。解决这一问题的方法是从制备和选用吸 附剂上着手。固相化金属亲和层析（IMAC）是新发展的一种亲 和层析技术。蛋白质分子中的咪唑基和巯基可与一些 金属元素（如Cu2、Zn2+等）形成配位结合，使蛋 白质得到分离纯化。6、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来 纯化蛋白质蛋白质分子上有疏水区，它们主要由酪氨酸、亮 氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等非极性的侧 链密集在一起形成，并暴露于分子表面。这些疏

9、水 区，能够与吸附剂上的疏水基团结合，再通过降低 介质的离子强度和极性，或用含有去垢剂的溶剂， 增高洗脱剂的pH值等方法将蛋白质洗脱下来。用含酚基疏水基团的琼脂糖纯化重组人表皮生长 因子（rhEGF），纯度可达94%，回收率达82%。7、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白 质这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分 配为基础的分离过程，称之为逆流分溶。利用逆流分 溶技术分离垂体激素、氨基酸、DNA是很有效的。8根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯 化蛋白质蛋白质易受pH、温度、酸、碱、金属离子、蛋白 沉淀剂、络合剂等的影响，由于各种蛋白质都存在着 差异，可利用这种差异来纯化蛋

10、白质。白蛋白在弱酸性条件下加辛酸钠可耐受67的温度 ，而其他蛋白质将变性。 球蛋白或白蛋白在碱性条件下，可以和利凡诺作 用，形成络合物而与其他蛋白质分离。细胞色素C 和胰岛素可用一定浓度的蛋白沉淀剂如三氯醋酸沉 淀，而保存其活力。 9、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有结晶磷 酸钙（羟灰石）、磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、 硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。诸如催 产素、胰岛素、HCG、HMG、细胞包素C等都可以 通过吸附层析技术进行纯化。10、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质对于酶蛋白超氧化物歧化酶（SOD）的提取， 因SOD能抵抗蛋白酶的水解，可用

11、蛋白水解酶降解其 他蛋白质，以便于SOD进一步的纯化。球蛋白、ACTH在分子中有活性中心，可用蛋白 酶水解切去与生物活性无关的分子部分，保留活性分 子片断，使产品纯化。对于无胰岛素生物活性的胰岛素原，用蛋白水解 酶可切去胰岛素原分子中的C-肽，使胰岛素激活。一些活性多肽常与其他蛋白质分子结合而不呈现活 性或不能够被提取，用蛋白水解酶可以使其与其它蛋 白质解离，恢复其生物活性和在溶液中的正常性质（三蛋白质的分离和纯化1时间因素在蛋白质分离和纯化过程中，共同的问题是蛋白 质反应达到平衡所需要的时间，而且为避免蛋白质 的变性、微生物的污染等，操作常在低温环境中进 行。 为更快达到反应平衡，应该考虑到

12、这些因素。通 常在25时，化学反应的速率是低温5时的34倍 。这与物质的扩散系数有关，而扩散系数受物质的 粘度和温度的影响。蛋白质生物大分子反应与小分 子化合物不同，后者是以分、秒和毫秒计时的，而 前者要10分钟以上。（四）溶液中蛋白质浓度的测定溶液中蛋白质的浓度可根据它们的物理、化学性 质，如折射率、比重、紫外光吸收来测定；化学反应方法，如凯氏定氮、双缩脲反应、福林- 酚反应测定；也可用染色法，如氨基黑、考马斯亮 蓝测定；此外还可用荧光激发、氯胺T、放射性同位素计 数等灵敏度较高的方法。上述方法，紫外吸收法、双缩脲法、福林酚试 剂法、考马斯亮蓝染色法最为常用。（五）纯度检查测定蛋白质的纯度是

13、化学和物理学的概念，它和蛋 白质所具有的生物活性有着更复杂的关系，蛋白质的 聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用等极大地 影响其生物活性，而这些因素的影响有些往往是用一 般纯度检查的方法所查不出来的，纯度检查的方法有 ：1、HPLC或FPLC这是蛋白质纯度检查常用的有效方法。美国药典 已规定把HPLC用于胰岛素纯度的检测项目中。2、电泳法 3免疫化学法（适用于产生特异性抗体的蛋白）4生物测定法利用动物体或动物的离体器官、细胞进行生物 效价的测定，这种方法接近动物临床所产生的生物 学效应，因此实际意义也更大。5、分光光度法（1）紫外分光光度法（2）红外分光光度法 (蛋白分子结构有特别能级， 红

14、外提供分子指纹)二、多肽与蛋白质的化学合成多肽的合成是50年代开始，在有机溶剂中进行的 均相反应，因此叫作液相合成法，此法在合成分子 量不太大的多肽时是比较成功的，但在合成更大的 蛋白质时，产物还不能表现出全部活力且不能结晶 ， 1962年建立的固相合成的新方法，对小肽的合 成是很成功的，对大分子的合成，如124肽的核糖核 酸酶，还不能达到天然物质的全部活力。目前试图合成大的蛋白质以及建立快速简便的合 成方法是多肽合成化学的特征。 在多肽合成中，一般需要以下几个主要步骤： 氨基保护和羧基活化；羧基保护和氨基活化；接肽和除去保护基团。 （一）基团保护 要实现控制多肽合成，如N-末端氨基酸残基的自

15、 由-NH2、C-末端氨基酸残基的自由-COOH以及侧链 上的一些活泼基团，加以封闭或保护。待肽链形成 之后，再将保护基除去。作为保护基，必须既能在 接肽时起到保护作用，在接肽以后，能很容易地除 去，且不致引起肽链的断裂。应用最多的氨基保护剂是苄氧羰酰氯（Cbz-Cl）， 可用催化氢化法或钠氨法（用金属钠在液氨中处理） 除去保护基，也可用叔丁氧羰酰氯（BOC-Cl）作保 护剂，用稀盐酸或乙酸在室温除去保护基。羧基保护剂通常用无水乙醇或甲醇在盐酸存在下 进行酯化，使羧基接上烷基。除去保护基可在常温下 用氢氧化钠皂化法。有些氨基酸还有其他功能基团，在合成肽时，都 要用适当的保护基团加以保护。例如组

16、氨酸的咪唑基 、丝氨酸的羟基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基等 ，都可用苄基（B2）保护，用钠氨法除去。谷氨酸 和天门冬氨酸的及-羧基可用-及-苯甲酯保护， 用催化氢化法除去。精氨酸的胍基用对甲基磺酰基（ Tos-）保护。（二）肽的液相合成法接肽反应除用缩合剂来完成外，还可以用分别活 化参与形成肽链的氨基和羧基的方法来完成。因活 化氨基的反应激烈，而且常常产生消旋化，所以， 总是采用羧基活化的方法，合成肽的常规方法是从C -端向N-端进行。肽的合成法可分为阶梯伸长法和片断缩合法。 阶梯伸长法是将带有R-O-CO-型保护基的氨基酸（ 不是肽）的羧基活化，从肽的C-端开始每次接上一 个氨基酸，逐步递增的办法。这是合成比较小的肽 或肽段常采用的方法。片断缩合法是由小肽缩合成 大肽的方法，为了避免消旋，常用叠氮法接肽。2，片断缩合法由小肽合成大肽时常用叠氮法，因叠氮法有较好的 产品光学纯度（不消旋）。由小肽接成大肽时，为了保证光学纯度，应尽量利 用Gly和Pro这两个氨基酸的C