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1、第二章 细胞生物学研究方法Chapter 2 Methods in Cell Biology Research 细胞形态结构的观察方法Methods for observing cell morphology and structures 细胞组分的分析方法Methods for analyzing cell constituents 细胞培养、细胞工程Cell culture and cell engineering 细胞及生物大分子的动态变化Dynamic analysis of biological macromolecules in cells 用于细胞生物学研究的模式生物Model
2、organisms in cell biology 第一节 细胞形态结构的观察方法各类细胞直径的比较显微镜电子显微镜复式显微镜倒置相差显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜光学显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜研究用显微镜单式显微镜普通光学显微镜扫描隧道显微镜光学显微镜的分辨率 resolution of optical microscope分辨率(resolution)区分开两个质点间的最 小距离.对任何显微镜来说，最重要的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。普通光镜的最大分辨率是0.2m。0.2um0.2nm0.1nm一、普通复式光学显微镜技术1、普通光学显微镜 light micr
3、oscope2、相差显微镜 phase contrast microscope将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，提高对比度，构造上的特殊之处 ： 环形光阑（condenser annulus） 相位板（annular phase plate）用途：可以观察未经染色的标本和活细胞F. Zernike于1935年 发明并因此获1953年 诺贝尔物理奖倒置相差显微镜 inverted phase contrast microscope物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下， 后者在载物台之上，可以用于观察培养皿中 的活细胞。3、微分干涉显微镜 differential interference c
4、ontrast (DIC) microscope在相差显微镜原理的基础上，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明 暗效果，能显示结构的三维立体投影。与相差显微镜相比，立体感更强4、荧光显微镜 fluorescence microscope为落射式照明，即光源通过物镜投射于样品 光源为波长较短的光，分辨力强 用于观察细胞组分特异发出的自然或标记荧光集多种功能于一体的万能研究显微镜兼有明视野、相差、微分干涉、 荧光、显微摄影等功能，是高级 研究仪器。5、激光共聚焦扫描显微镜 laser confocal scanning microscope 激光作光源； 通过检测器前小孔成像； 扫描激光聚焦点也
5、是瞬时 成像焦点共聚焦。 分辨力为普通光镜的1.4-1.7倍.Epi-fluoresceneConfocal荧光显微镜与扫描共焦显微镜的比较（小鼠肾小球）Alexa Fluor 488 wheat germ agglutinin, a green-fluorescent lectin, was used to label elements of the glomeruli and convoluted tubules. The filamentous actin prevalent in glomeruli and the brush border were stained with red-
6、fluorescent Alexa Fluor 568 phalloidin. The nuclei were counterstained with the blue-fluorescent DNA stain DAPI. Molecular Probes FluoCells prepared slide #3 (F24630)Zeiss Plan-Neofluor 40x/1.30 OilZeiss C-Apochromat 40x/1.1 W Corr梁凤霞提供梁凤霞提供荧荧光观观察细细胞结结构细细胞内的动态变动态变 化FRETFRP鲁斯卡(19061988)，德国物理学家，1932年研
7、制第一台电子显微镜，1986 年获诺贝尔物理奖。二、电子显微镜技术Electron microscopy1、光镜与电镜的主要区别（1）光源不同: 可见光/紫外线-电子束（2）透镜不同:玻璃-电磁透镜（3）真空（4）显示记录系统（5）分辨率: 0.2 um -0.2 nm1、透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM透射式电子显微镜用于观察小于0.2m的细微结构，称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures）.Figure 3-20. Electron mic
8、rograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. 超薄切片制样技术取材 固定 脱水 渗透、包埋 超薄切片厚度40-50nm染色电镜的实际分辨率与切片厚 度有关负染色技术 Negative staining 负染色是用重金属盐对铺展在载网上的样品进 行染色，吸去多余染料，样品经自然干燥后， 整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬 托出样品的精细结构。 Figure 3-29. Electron micrograph of negatively stained actin filaments. E
9、ach filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be composed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.) 亦称冰冻断裂，主要用来观察膜断裂面的蛋白 质颗粒和膜表面结构。冷冻蚀刻电镜技术 Freeze Etching electron microscopy2、扫描电子显微镜 scanning electron microscope, SEM20世纪60年代问世，用来观察标本的表面
10、结构目前扫描电镜的分辨力为 610 nm。Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison, the same structure is shown by differential- interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section
11、electron microscopy (C).三、扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope, STMBinnig和Rohere 1981年发明，1986年获奖；可观察到原子级的图像。A.X-ray crystallographyX射线衍射B. NMR spectroscopy 核磁共振成像第二节 细胞组分的分析方法一、用离心技术分离细胞器与生物大分子普通离心机：转速25000 r/min超速离心机：30000 r/min在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和 细胞器 。1、差速离心 differential centrifugati
12、on细胞器沉降顺序：核、线粒体、溶酶体与过 氧化物酶体、内质网与高基体。2、密度梯度离心 density gradient centrifugation 用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，细胞混悬液或匀浆置于 介质顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖分为速度沉降（velocity sedimentation）和等密度沉降（equilibrium sedimentation） 。其它生化分离方法纸色谱 柱色谱亲和色谱Figure 3-42. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE).Figu
13、re 3-44. Separation of protein molecules by isoelectric focusing.Figure 3-45. Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis.二、细胞内核酸、蛋白质、糖等成分的显示方法为了对某些细胞成分进行定性和定位研究，利用染色剂可与细胞某种成分发生反应而着色的原理加以显示，称为组织化学和细胞化学染色方法（ histochemical and cytochemical staining method）；如：细胞内DNA和RNA的原位显示 Myofibrillar ATPase:
14、 Identifying Fast and Slow FibersSuccinate Dehydrogenase(琥珀脱氢酶): Identifying Oxidati ve Potential Promoter:GUS是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术，常用的标记物有荧光素和酶免疫荧光法（immunofluorescent technique）酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）免疫细胞化学 immuno-cytochemistry二、细胞内特异蛋白质的定位和定性免疫荧光法酶标免疫法 利用分子探针检测细胞内特殊DNA序
15、列、和RNA基因表达的方法。四、细胞内特异核酸序列的定位和定性原位杂交（in situ hybridization）人类染色体端粒DNA的荧光原位 杂交照片果蝇HB基因表达的原位杂交照 片五、定量细胞化学分析技术对单个细胞进行快速定量分 析分选的一门技术；流式细胞术 flow cytometry第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 活体或在体(in vivo ) 离体或体外(in vitro ) 细胞培养 (cell culture) 就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术；原代培养 (primary culture)：从动物机体取出进行培养的细胞群。传代培养 (passage)
16、：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。细胞株 (cell strain) 和细胞系(cell line)一、动物细胞培养 cell culture二、植物细胞培养组织培养 (tissue culture)：诱发产生愈伤组织，诱导再分化可培养出再生植株 单倍体培养(haploid culture )：花药或花粉培养获得单倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合的个体原生质体培养(protoplast culture)：两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合 (cell fusion)或细胞杂交 (cell hybridization)基因型相同的细胞融合称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞称为异 核体；诱导方法：生物(病毒)、化学(PEG)、物理(电激、激光)。三、细胞工程 细胞融合单克隆抗体技术 mo
