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1、Fluorescence microscopyMainly fluorescence detector systems are color-blind!(Colors are based on a pseudo-color look-up table)荧荧 光光 显显 微微 镜镜荧光显微镜的优点和用途荧光显微镜的优点和用途优点：优点： 检出能力高检出能力高 对细胞的刺激小对细胞的刺激小 能进行多重染色能进行多重染色 用途：用途： 物体构造的观察物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析发荧光量的测定对物质定性、定量分析什
2、么是荧光什么是荧光 ? ?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转物质中的电子吸收光的能量由低能状态转 变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光 。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。一种光化荧光一种光化荧光 Basic idea of fluorescence microscopy: Stokes shiftE = hn c = lnE 1 / l荧光的种类荧光的种类. .自发荧光自发荧光（不加染色） ;. .二次荧光二次荧光（用化学染色） ; ;.抗体荧光技术（用免疫染色）;自发荧光：自发荧光：有些物质不加染色，也能发
3、出荧 光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生 物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。激发光激发光发射光发射光二次荧光（用化学染色）非荧光性的物质（ 蛋白质、炭水化合 物）用荧光色素染 色，由荧光色素产 生荧光（二次荧光 ），以便进行观察 。对特定物体选择 合适的荧光色素， 该物体就能和周围 的组织或细胞区别 出来而可以观察到 。抗体荧光技术（用免疫染色） :利用特定的抗原 必然和特定的抗 体相结合这一个 事实，有意识地 使带荧光标记的 抗体和标本中的 抗原进行抗原/抗 体反应，这样两 者的结合体就能 通过抗体的荧光 观察到。荧光的性质荧光的性质 吸收光吸收光 保持固有的荧光特性保持固有的荧光特
4、性 荧光波长激发波长（荧光波长激发波长（STOKES STOKES 法则）法则） 荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓荧光强度取决于激发光强度、被检物浓 度、荧光效率度、荧光效率荧光显微镜的种类荧光显微镜的种类透射式透射式 落射式落射式荧光显微镜的主要部件荧光显微镜的主要部件透射式透射式 汞灯光源汞灯光源 激发滤色镜激发滤色镜 暗场聚光镜暗场聚光镜 吸收滤色镜吸收滤色镜落射式落射式 汞灯光源汞灯光源 激发滤色镜激发滤色镜 分色镜分色镜 吸收滤色镜吸收滤色镜暗视野照明方式 聚光镜中央有档 光片，使照明光 线不直
5、接进入物 镜，只允许被标 本反射和衍射的 光线进入物镜， 因而视野的背景 是黑的，物体的 边缘是亮的。dark field without specimenobject planeobjectivecondensorBright and dark field illumination- ring diaphragm (usually) - dark field condensorspecimendark field with specimenBright and dark field illuminationBright field total illumination of the spec
6、imen direct light collection by objective dark/colored object on bright backgroundObjects with a sharp rise in refraction indexDark field part-illumination of the specimen scattered light collected by objective bright object on dark backgroundObjects with high contrast(with modification http:/mikros
7、kopie.de)透射荧光显微镜的构造透射荧光显微镜的构造吸收滤色镜吸收滤色镜暗场聚光镜暗场聚光镜激发滤色镜激发滤色镜汞灯箱汞灯箱落射荧光显微镜的构造落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜 汞灯汞灯紫外线保护罩紫外线保护罩孔径光栏孔径光栏（FSFS）视场光栏视场光栏（ASAS）Immersion objectives: Remember the refraction index!Immersion objective with specimenrefraction index (n) air 1.00 water = 1.37 oil = 1.5 glass
8、= 1.5EmissionExcitation DMLight sourcemedium (water or oil)water or oil immersion objectivespecimen透射荧光显微镜 优点： 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因 此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。 透射荧光显微镜 缺点： 必须须正确调调整聚光镜镜中心和高度，否则则不能获获得明亮的 荧荧光像。 由于暗视场视场 聚光镜镜焦距限制，不能使用厚的载载玻片。 视场视场 照明区不能过过大，否则则容易使荧荧光标标本荧荧光色
9、衰褪 。 厚的或不透明的标标本不适用。 反射荧光显微镜 优点： 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高 分辨率的像。 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透 射微分干涉差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。 反射荧光显微镜 缺点： 在用低倍率物镜时镜时 ，像比较较暗，因此必须须用 大数值值孔径的物镜镜。 滤滤光镜镜系统统必须须有效地分离开激发发光和荧荧光 。 落射荧光显微镜各部件特性和作用落射荧光显微镜各部件特性和作用 汞灯光
10、源汞灯光源: :提供激发光提供激发光(U(U、V V、B B、G)G) 激发滤色镜激发滤色镜: :波长选择波长选择nmT%BAND PASSBAND PASS落射荧光显微镜各部件特性和作用落射荧光显微镜各部件特性和作用 吸收滤色镜吸收滤色镜: :透过荧光透过荧光, ,阻挡杂光阻挡杂光 分色镜分色镜: :反射激发光反射激发光, ,透过荧光透过荧光A A 透过透过AA A 反射反射BB B 透过透过B B 阻挡阻挡nmnmT%T%落射荧光显微镜原理落射荧光显微镜原理汞汞 灯灯激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜吸收滤色镜吸收滤色镜物物 镜镜 标标 本本透射荧光显微镜原理目镜目镜吸收滤色镜吸收滤色镜物镜
11、物镜暗场聚光镜暗场聚光镜激发滤色镜激发滤色镜汞灯汞灯滤色镜的选择滤色镜的选择荧光素的特性荧光素的特性滤色镜的特性滤色镜的特性激发激发分色分色吸收吸收根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜激发滤色镜的选择激发滤色镜的选择激发滤色镜激发滤色镜吸收滤色镜吸收滤色镜FITC FITC 吸收吸收FITC FITC 发射发射分色镜分色镜-激发滤色镜的带宽应尽量符合荧光色素的特性激发滤色镜的带宽应尽量符合荧光色素的特性激发滤色镜带宽对图象的影响激发滤色镜带宽对图象的影响SWB: BP420-480SWB: BP420-480WB: BP450-480WB: BP450-480W
12、IB: BP460-490WIB: BP460-490NB: BP470-490NB: BP470-490FITC+PIFITC+PI多重染色标本的多色观察多重染色标本的多色观察DAPI+FITC+Texas RedDAPI+FITC+Texas Red-选用特制的多色滤色镜选用特制的多色滤色镜三色滤色镜的特性曲线三色滤色镜的特性曲线激发激发分色分色吸收吸收双重染色标本的单色和双色观察双重染色标本的单色和双色观察NUANUA WIBWIB DUALDUALBAND (BAND (特制）特制）WIBAWIBAWIGWIGWIBWIBDAPI+FITCDAPI+FITCFITC+PIFITC+PI
13、-选用单色和双色滤色镜选用单色和双色滤色镜单色滤色镜的特性曲线单色滤色镜的特性曲线双色滤色镜的特性曲线双色滤色镜的特性曲线现行荧光显微镜特点和各种滤色镜现行荧光显微镜特点和各种滤色镜 激发激发/ /分色分色/ /吸收一体化吸收一体化 - CUBE- CUBE 同时安装同时安装4 4组或组或6 6组组CUBE(CUBE(另可提供另可提供8 8组型组型) ) 数十种通用和专用数十种通用和专用CUBECUBE供选择供选择Free CubeFree Cube吸收滤色镜吸收滤色镜激发滤色镜激发滤色镜分色镜分色镜根据需要随意选择各种波长滤色镜根据需要随意选择各种波长滤色镜早早 期期 荧荧 光光 显显 微微
14、 镜镜早早 期期 荧荧 光光 显显 微微 镜镜 附附 件件有很多辅助滤色镜有很多辅助滤色镜早早 期期 荧荧 光光 滤滤 色色 镜镜 特特 点点宽宽 带带 激激 发发辅助激发和辅助吸收滤色镜的特性辅助激发和辅助吸收滤色镜的特性辅辅 助助 激激 发发 滤滤 色色 镜镜 的的 运运 用用辅助吸收滤色镜的运用辅助吸收滤色镜的运用激发激发分色分色 吸收吸收 荧光荧光辅助吸收辅助吸收杂光杂光nmnmT%T%油油 镜镜 应应 使使 用用 荧荧 光光 油油物镜光栏的运用物镜光栏的运用光栏全开启光栏全开启光栏适当关小光栏适当关小物镜光栏物镜光栏适当调节物镜光栏以获得最佳效果适当调节物镜光栏以获得最佳效果荧光的衰
15、减荧光的衰减防衰减的方法防衰减的方法 使用抗衰减剂使用抗衰减剂 选择衰减小的荧光素选择衰减小的荧光素 降低激发光强度降低激发光强度 降低标本中氧的浓度降低标本中氧的浓度有衰减的标本有衰减的标本使用抗衰减剂的效果使用抗衰减剂的效果广泛应用的抗衰减剂广泛应用的抗衰减剂使用要点使用要点 标本制作标本制作 选用荧光物镜选用荧光物镜 正确选择滤色镜正确选择滤色镜 调节光源中心调节光源中心 油镜应使用荧光油油镜应使用荧光油 光栏物镜应适当调节物镜光栏物镜应适当调节物镜 光栏光栏 适当调节孔径光栏和视场适当调节孔径光栏和视场 光栏光栏各种汞灯灯箱各种汞灯灯箱汞灯中心调节方法汞灯中心调节方法 放置一张白纸于载物台上放置一张白纸于载物台上 转入转入B B激发滤色镜激发滤色镜 用用10X10X物镜观察并聚焦白纸物镜观察并聚焦白纸 取下取下10X10X物镜物镜 通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸 通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心 于白纸上圆环中心于白纸上圆环
