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1、预防兽医学专业毕业论文预防兽医学专业毕业论文 精品论文精品论文 牛牛 干扰素抗原捕获干扰素抗原捕获ELISAELISA 检测方法的建立及初步应用检测方法的建立及初步应用关键词：牛结核病关键词：牛结核病 牛结核分枝杆菌牛结核分枝杆菌 IFN-IFN- ELISAELISA 检测法检测法摘要：牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核 分枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等 20 多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化 道途径感染人类。研究表明，10的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起， 所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目 前尚无有效疫苗预防牛结核病，
2、所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病 传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛 结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN- 作为 Th1 型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著 升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990 年 Wood 建立 抗原特异性牛 IFN- 夹心 ELISA 方法用于牛结核病检测，已在多国应用，评价 较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在 我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通
3、过对本室研制的 13 株小鼠抗 rHis-BoIFN- 单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出 3 株针对天然牛 IFN- 的单抗，经初步 配对建立牛 IFN- 夹心 ELISA 检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗 rHis-BoIFN- 多抗血清配对建立了牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法，可有 效检测天然牛 IFN-。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本奶牛天然 IFN- 与进口试剂盒符合率为 83.9。这为进一步开发牛 IFN- ELISA 试剂 盒以及牛 IFN- ELISPOT 检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提
4、供了 一种有效检测试剂。 1.抗牛 IFN- 单克隆抗体的鉴定 采用 Dot-ELISA 方 法对 13 株单抗分别与 rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-、rGST- BoIFN-、rHis-ChIFN-、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及 BL21(DE3)(pET)和 BL21(pGEX-6P-1)经 IPTG 诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定；通过 Western-blot 试验鉴定单抗与重组菌 BL21(DE3)(pET-BoIFN-)、BL21(DE3) (pET)全菌蛋白的反应性；通过间接 ELISA 实验证明 13 株
5、单抗与商品化 rBoIFN- 反应性，最终确定 13 株单抗均特异针对 rBoIFN- 而不与无关蛋白 成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗 9G11，其余单抗腹水效 价都在 1：80000 以上。 2.牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法的建立 采 用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性 好的纯化抗体。采用相加 ELISA 实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针 对不同抗原表位的单抗 6F8、1G5 进行生物素化，同时用 HRP 标记单抗 8D3。得 到 Biotinylated6F8 效价为 1:10000，HRP-8D3 效价为 1：
6、3200。用本室保存的 rHis-BoIFN- 做待检抗原，单抗 3E6/1C12 与 Biotinylated6F8 直接配对建立 了 rBoIFN- 双抗体夹心 ELISA 检测方法，灵敏度达 0.5ng/mL，并能检出 1.6ng/mL 商品化 rBoIFN-，但检测天然 BoIFN- 效果不佳。所以我们又建立 了 BoIFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法。 以 rHis-BoIFN- 做免疫原免疫兔 子制备了兔抗 rHis-BoIFN- 多抗血清。用 PWM 刺激奶牛全血产生的天然 BoIFN- 筛选出与之反应的三株单抗 5E11、6F8、8D3。将单抗 5E11 按照40g/mL
7、 浓度包被与 1：3000 倍稀释的兔抗 rHis-BoIFN- 多抗血清配对，以 1：6000 稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法，可有效检测天然 BoIFN-。 3.牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法的初步应用 用进口试剂盒 Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle 对江苏部分地区奶牛结核病做调查，期间检 测 A 地奶牛 117 头，检出禽结核阳性 15 例，可疑牛结核 3 例，未检出阳性牛结 核。检测 B 地奶牛场奶牛 59 头，检出 9 例牛结核阳性，2
8、例禽结核阳性，可疑 牛结核 10 例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部 分临床检测血清样本用牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 方法检测，两种方法检测牛 IFN- 的符合率达到 83.9。 结果表明建立的牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检 测方法能有效检测天然牛 IFN-，这为进一步开发牛 IFN- ELISA 试剂盒以 及牛 IFN- ELISPOT 检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了一种 有效检测试剂。正文内容正文内容牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分 枝杆菌可以感染奶牛、鹿、獾等 20 多种温血动物，还可以通过呼吸道及
9、消化道 途径感染人类。研究表明，10的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起， 所以牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目 前尚无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病 传播。结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛 结核病的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN- 作为 Th1 型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著 升高，这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990 年 Wood 建立 抗原特异性牛 IFN- 夹心 ELISA 方法用于牛结核
10、病检测，已在多国应用，评价 较好，有望替代传统牛结核病检测方法。但由于进口试剂盒价格昂贵，难以在 我国推广，所以应该着力开发我国自主知识产权的新型牛结核病检测试剂盒。 本研究通过对本室研制的 13 株小鼠抗 rHis-BoIFN- 单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)进行鉴定，筛选出 3 株针对天然牛 IFN- 的单抗，经初步 配对建立牛 IFN- 夹心 ELISA 检测方法，但效果不佳。后将单抗与制备的兔抗 rHis-BoIFN- 多抗血清配对建立了牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法，可有 效检测天然牛 IFN-。初步临床应用显示建立的方法检测临床样本
11、奶牛天然 IFN- 与进口试剂盒符合率为 83.9。这为进一步开发牛 IFN- ELISA 试剂 盒以及牛 IFN- ELISPOT 检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防控提供了 一种有效检测试剂。 1.抗牛 IFN- 单克隆抗体的鉴定 采用 Dot-ELISA 方 法对 13 株单抗分别与 rHis-BoIL-4、rGST-BoIL-4、rHis-BoIFN-、rGST- BoIFN-、rHis-ChIFN-、rHis-ChIL-4、rGST-ChIL-4，以及 BL21(DE3)(pET)和 BL21(pGEX-6P-1)经 IPTG 诱导后的超声波裂解液上清的反应性进行鉴定；通过 We
12、stern-blot 试验鉴定单抗与重组菌 BL21(DE3)(pET-BoIFN-)、BL21(DE3) (pET)全菌蛋白的反应性；通过间接 ELISA 实验证明 13 株单抗与商品化 rBoIFN- 反应性，最终确定 13 株单抗均特异针对 rBoIFN- 而不与无关蛋白 成分反应。对体内诱生的腹水效价进行测定发现除单抗 9G11，其余单抗腹水效 价都在 1：80000 以上。 2.牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法的建立 采 用辛酸-硫酸铵两步法对体内诱生的单抗腹水进行纯化获得了纯度高、生物活性 好的纯化抗体。采用相加 ELISA 实验对单抗针对的抗原表位进行鉴定，并对针 对
13、不同抗原表位的单抗 6F8、1G5 进行生物素化，同时用 HRP 标记单抗 8D3。得 到 Biotinylated6F8 效价为 1:10000，HRP-8D3 效价为 1：3200。用本室保存的 rHis-BoIFN- 做待检抗原，单抗 3E6/1C12 与 Biotinylated6F8 直接配对建立 了 rBoIFN- 双抗体夹心 ELISA 检测方法，灵敏度达 0.5ng/mL，并能检出 1.6ng/mL 商品化 rBoIFN-，但检测天然 BoIFN- 效果不佳。所以我们又建立 了 BoIFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法。 以 rHis-BoIFN- 做免疫原免疫兔 子制备了
14、兔抗 rHis-BoIFN- 多抗血清。用 PWM 刺激奶牛全血产生的天然 BoIFN- 筛选出与之反应的三株单抗 5E11、6F8、8D3。将单抗 5E11 按照 40g/mL 浓度包被与 1：3000 倍稀释的兔抗 rHis-BoIFN- 多抗血清配对，以 1：6000 稀释的商品化羊抗兔酶标抗体做指示抗体建立牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法，可有效检测天然 BoIFN-。 3.牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检测方法的初步应用 用进口试剂盒 Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle 对江苏部分地区奶牛
15、结核病做调查，期间检 测 A 地奶牛 117 头，检出禽结核阳性 15 例，可疑牛结核 3 例，未检出阳性牛结 核。检测 B 地奶牛场奶牛 59 头，检出 9 例牛结核阳性，2 例禽结核阳性，可疑 牛结核 10 例。这在一定程度反应出两地牛结核病控制措施的差异。将获得的部 分临床检测血清样本用牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 方法检测，两种方法检测牛 IFN- 的符合率达到 83.9。 结果表明建立的牛 IFN- 抗原捕获 ELISA 检 测方法能有效检测天然牛 IFN-，这为进一步开发牛 IFN- ELISA 试剂盒以 及牛 IFN- ELISPOT 检测方法奠定了基础，也为我国牛结核病防
16、控提供了一种 有效检测试剂。 牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种重要人兽共患病。牛结核分枝杆 菌可以感染奶牛、鹿、獾等 20 多种温血动物，还可以通过呼吸道及消化道途径 感染人类。研究表明，10的人类结核病例由牛结核分枝杆菌感染引起，所以 牛结核病不仅给畜牧业造成重大经济损失还严重威胁人类健康。 由于目前尚 无有效疫苗预防牛结核病，所以各国普遍采取“检疫-扑杀”策略控制疾病传播。 结核菌素皮内变态反应实验(Tuberculin skintest，TST)一直被用于牛结核病 的检测，但其敏感性低、特异性差、难以检测早期牛结核感染。IFN- 作为 Th1 型细胞免疫效应的主要指征在牛结核分枝杆菌感染早期分泌水平显著升高， 这为开发早期牛结核病的有效检测试剂指明了方向。1990 年 Woo
