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1、College of Life Science and BiotechnologycDNA文库构建及EST序列分析陈威、丁立建、黄显军、刘振英、毛海花、上官巧灵、朱竹君 （按姓氏首字母排列，排名不分先后）College of Life Science and Biotechnology组员任务分配陈 威：统筹安排、资料收集丁立建：cDNA文库应用、资料收集黄显军：背景简介刘振英：cDNA文库构建原理、资料收集毛海花、上官巧灵、朱竹君：EST序列分析College of Life Science and Biotechnology目录一、背景简介二、cDNA文库构建原理三、cDNA文库的应用四、
2、EST序列分析五、参考文献College of Life Science and BiotechnologycDNA文库构建及EST序列分析 背景简介黄显军College of Life Science and BiotechnologycDNA基因文库：某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 College of Life Science and Biotechnology1. cDNA文库背景简介1.1 cDNA文库产生前的技术概况随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要
3、工作。在过去寻找新基因的方法有：a）消减杂交b）mRNA 差异显示c）cDNA 的代表性差异显示分析法d）差异消减展示等方法这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的 基因。College of Life Science and Biotechnology1.2 cDNA文库的产生由于以前技术的缺点，目前，比较可行而且应用较多 的方法主要是 cDNA 文库的筛选。一方面 cDNA 文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分序列，因 此 cDNA 克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多。另一方面
4、由于每个 cDNA 克隆只代表一种 mRNA 序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低 。所以 cDNA 文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。College of Life Science and Biotechnology1.3. 为什么要构建cDNA文库？cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因 组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文 库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目 的基因的表达。College of Life Science and Biotechnology1.4. 怎么构建cDNA文库 ？College of Life Science and
5、 Biotechnology1.5. cDNA文库构建后能干什么？1)可保护濒危珍惜生物资源2)可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针3)可以用于分离全长基因进而开展基因功能研 究College of Life Science and Biotechnology1.6. cDNA文库的优势及价值1）优势：cDNA在研究具体某类特定细胞中基 因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具 有特殊的优势。2）价值：在个体发育、细胞分化、细胞周期调 控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中 具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常 使用到的基因文库。 College of Life Science and
6、 Biotechnology2. EST序列分析背景简介克隆全长cDNA序列的传统途径：a)噬斑原位杂交的方法b)采用PCR的方法缺点：工作量大、耗时、耗材这些传统方法已满足不了人类基因组时代迅 猛发展的要求。College of Life Science and Biotechnology2.1. EST序列分析的产生随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、 表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分 利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同 时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑 战性的课题摆在我们面前。采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs） 序列，获得
7、基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克 隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的 充分发挥提供广阔的空间。College of Life Science and Biotechnology2.2. EST技术的作用价值EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因 组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得 即昂贵又费时。因为基因组中只有2%的序列编码蛋白 质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行 大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建 各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模 cDNA测序时代的到来
8、。虽然ESTs序列数据对不精确， 精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新 基因的发现与研究。 College of Life Science and Biotechnology目录一、背景简介二、cDNA文库构建原理三、cDNA文库的应用四、EST序列分析五、参考文献College of Life Science and BiotechnologycDNA文库的构建 刘振英College of Life Science and Biotechnology为什么构建cDNA文库College of Life Science and Biotechnology 真核生物基因结构原核生
9、物有很大差异。真核生物的基因不能直接在原核生物中表达 ,只有将加工 成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），并连接相应的 原核细胞表达控制元件，才能在原核生物中表达。 mRNA的不稳定性真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的 不稳定性，因而对真核基因的表达和相关的mRNA研究，一般都 是通过对cDNA的研究来进行。College of Life Science and BiotechnologyBut如何构建 cDNA文库College of Life Science and Biotechnologywww.themegallery. comLOGOCollege
10、 of Life Science and BiotechnologymRNA的分离制备寡聚胸苷酸oligo(dT)纤维素或琼脂糖亲和层 析法，在高盐缓冲溶液中poly(A)RNA与 oligo(dT)结合，低盐缓冲溶液使它们解离。www.themegallery. comLOGOCollege of Life Science and BiotechnologycDNA 第一链的合成 Oligo（dT）引导的 cDNA 合成高浓度的Oligo（dT）引物与 mRNA 的 3 末端的 poly（A）配对。优点：逆转录反应基本被限定在以mRNA为模板 ，故即使样品中混有少量的rRNA时不会影响cDN
11、A文 库构建的质量。缺点：只能从mRNA3末端其起始引发cDNA的合 成，由于逆转录酶的能力有限，平均合成出的cDNA 长度在1kb以下，因此合成cDNA 通常会缺少 mRNA5端的重要信息。www.themegallery. comLOGOCollege of Life Science and BiotechnologyCollege of Life Science and Biotechnology 随机引物引导的 cDNA 合成采用 610 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚 定 mRNA 并作为反转录的起点。由于随机引物可能 在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同 时发生反转录
12、，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5端序列。 优点：克服了oligo(dT)合成cDNA时缺少5端 序列的缺点， 能更有效的反映出表达mRNA全长的 序列信息。缺点：对mRNA样品的纯度要求苛刻。College of Life Science and BiotechnologycDNA 第二链的合成 自身引导法 置换合成法 PCR法College of Life Science and Biotechnologywww.themegallery. comLOGO方法一：自身引导法College of Life Science and Biotechnologywww.themegalle
13、ry. comLOGO方法二：置换合成法College of Life Science and Biotechnology方法三：PCR法College of Life Science and BiotechnologycDNA的克隆（1）修饰cDNA两端 （2）cDNA与载体相连 （3）导入宿主细胞:重组体在一定条件下导入宿主细胞培养或保存宿主 细胞必须是来自一个细胞的克隆体，以保证它们的遗传性状相同。LOGO www.themegallery. comCollege of Life Science and Biotechnologyhttp:/ 来，看个cDNA文库 构建的视频吧Colle
14、ge of Life Science and BiotechnologycDNA文库构建的其他方法 固相cDNA文库1998年，由Roeder开发的一种快速高效的cDNA 文库构建方法。它基于传统的cDNA文库合成方法，包含通常所需 的全部步骤。但在cDNA合成过程中引入了固相支持 物。cDNA通过一个生物素基固定在链霉卵白素偶联 的磁珠上，这样在反应中就可以简便而迅速的实现酶 和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库结合 在一起(构建文库只需一天)，并且构建的文库适合于 大多数的研究目的。College of Life Science and Biotechnology 优点：可以简便cD
15、NA合成的操作。在进行缓 冲液更换时既没有cDNA的丢失之忧，也无其 他物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真 实的代表性文库，它包含有短小的cDNA，这 是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总 之，固相法结合了传统的cDNA合成的优点并 弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉 ，所建文库高质量。College of Life Science and Biotechnology 差示cDNA文库差示文库又称为扣除文库，是反映不同组织和细胞 或同一细胞在不同功能状态下，基因表达差异的cDNA 文库。主要用于研究细胞的发育、分化、细胞周期、细 胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾病的研究
16、。基本流程：分别提取不同组织细胞或同一种细胞在 不同功能状态下细胞的mRNA，将其中一种细胞的 mRNA反转录成cDNA第一链，然后将该cDNA与另一 细胞过量的mRNA进行杂交，第一种细胞中若存在不同 于第二种细胞的特殊基因，则会产生特殊基因的mRNA 和cDNA，它们不能与第二种细胞的mRNA形成杂交体 。将未形成杂交体的cDNA分出，合成与之互补的 cDNA第二链，再以此双链cDNA构建cDNA文库，即差 示文库。College of Life Science and Biotechnology 标准cDNA文库 染色体或区域特异性cDNA文库 限制性cDNA文库 0ligocapping方法构建cDNA文库College of Life Science and Biotechnology丁立建College of Life Science and Biotechnolog
