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1、大肠菌群快速检测 纸片法山东省疾病预防控制中心阚方琦汇报提纲n1大肠菌群和粪大肠菌群的定义n2大肠菌群快检纸片法的检测原理n3大肠菌群快检纸片的种类及其使用方法n4大肠菌群快检纸片法的结果判定n5影响判定结果的因素n6大肠菌群快检纸片的应用现状及效果n7大肠菌群快检纸片的质量控制n8 使用大肠菌群快检纸片注意事项大肠菌群和粪大肠菌群的定义n1.大肠菌群：n大肠菌群（Coliform Bacteria)系指一群在37 培养 24h能分解乳糖产酸产气的需养或兼性厌氧革兰氏阴性 无芽胞杆菌。它是细菌卫生学中的一项重要指标。n2.粪大肠菌群：n粪大肠菌群(Faecal Coliform)是大肠菌群中的
2、一部分， 在37 和44.5 均能生长并发酵乳糖产酸产气，主要 来自粪便。将能在44.5生长并发酵乳糖产酸产气的 这一部分大肠菌群成为粪大肠菌群。粪大肠菌群数可 以作为被粪便污染的评价指标。大肠菌群和粪大肠菌群的定义n总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自 然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在 自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度 为25左右，如在37培养则仍可生长，但如 将培养温度再升高至445，则不再生长， 而直接来自粪便的大肠菌群细菌，习惯于37 左右生长，如将培养温度升高至445仍可 继续生长。大肠菌群和粪大肠菌群的定义n因此，可用提高培养温度方法将自然环境 中的大肠菌群与粪
3、便中的大肠菌群区分。 在37培养生长的大肠菌群，包括粪大肠 菌群)为“总大肠菌群”(Total coliform) ；在445培养的大肠菌群，为“粪大 肠菌群”(Fecal coliform) 。大肠菌群快检纸片的应用现状大肠菌群的检验，传统方法是乳糖胆盐试管发 酵法。上世纪90年代，大肠菌群快速检验的纸 片法被纳入食（饮）具、公共场所卫生和医院感 染等待测物体表面消毒卫生标准，作为餐具、饮 具或其它物体表面消毒效果检测的法定方法之一 。随即在全国卫生、疾控、环保等部门迅速推广 使用，并有了商品供应。此后，又将该法应用到 食品、饮料、水质、医疗机构污水污泥等样品的 大肠菌群检测。作为单位自检或
4、部门行业、地方 标准。大大提高了工作效率。大肠菌群快检纸片的应用现状n为了维护市场秩序，保障大肠菌群检测的 可靠性，原卫生部食品卫生监督检验所（ 现为中国CDC营养与食品安全所)在全国 范围内开展了对大肠菌群快检纸片产品的 跟踪质量调查,筛选出时为山东省卫生防疫 站等10家单位作为国内定点生产单位。并 每年进行至少一次抽查检验，直到2004年 ，由于我们的产品质量一直名列前矛，而 被定为免检产品。大肠菌群快检纸片的应用现状n纸片法检测大肠菌群，简便易行，节省成 本，结果准确，工作效率高，是微生物检 验诸多快速方法中比较成熟的方法之一， 已被广大卫生检验者所接受。目前已广泛 应用于食品、餐饮业、
5、卫生、环保、水质 检验等。大肠菌群快检纸片的应用现状n实际应用效果举例：n对食饮具的检测结果n对冷冻饮品的检测结果n对水的检测结果nGB2009年3月1日实施的食品卫生微生物 学检验大肠菌群计数，将乳糖胆盐培养基 改为月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤， 并不影响纸片法的应用。无论是乳糖胆盐、 LST或是纸片法，都遵循了大肠菌群的基本 概念，其检测原理都是发酵乳糖产酸产气。大肠菌群快检纸片法的检测原理n1.反应系统：n大肠菌群细菌在生长繁殖时，分解乳糖产酸n乳糖 葡萄糖+半乳糖n葡萄糖 丙酮酸 乙酸+甲酸n甲酸 H2+CO2n2 指示系统：n产酸会通过溴甲酚紫由紫色变黄色来显示；n脱下的氢可与
6、无色可溶性氯化三苯四氮唑（ TTC受氢体）发生氧化还原反应，形成不溶性 红色络合物三苯甲替（Formazan）。大肠菌群快检纸片法的检测原理n3. 大肠菌群快检纸片（以下简称“纸片”） 就是根据上述原理，以无菌层析滤纸为载体， 吸附一定量的乳糖、指示剂（溴甲酚紫和TTC ）、蛋白胨、抑菌剂等，在无菌条件下恒温干 燥制成。大肠菌群细菌通过溴甲酚紫指示剂显 示发酵乳糖产酸使纸片变黄，通过TTC与脱下 的H发生氧化-还原反应,在细菌生长的菌落处 形成红色斑点（或红晕）。这也是现行国标制 定阳性结果判定标准的理论依据。大肠菌群快检纸片法的检测原理n众所周知，酶是一种蛋白质，其活性随 温度和pH等变化而
7、改变，在高温和极端 酸性或碱性情况下，可完全丧失活性而 失去脱氢的能力。受氢体的作用也可能 受pH的影响，因此影响酶活性和导致pH 异常的任何因素均可影响检测结果。大肠菌群快检纸片的种类及其使用方法n1 餐饮具和待测物体表面用纸片：n组成和性状：每份2张55cm纸片，干燥纸片 为灰白色或淡绿色，加中性水湿润后为青紫色 。n使用方法： 将纸片用适量无菌蒸馏水浸湿（无 多余水分），贴于食饮具内侧表面或其他待测 物体表面规定位置，压实，使纸片与物体面充 分接触，30秒后取下，放于无菌袋内，37培 养16-18h观察结果。1大肠菌群快检纸片的种类及其使用方法n2 食饮品用大肠菌群快检纸片n组成与性状：
8、每份3袋吸附10ml样品稀释液的大纸片（双层 1111cm）和6袋吸附1ml样品稀释液的小纸片（55cm），干燥 纸片为灰白色或淡绿色，加稀释样品后为青紫色。n使用方法：根据检样形态及其污染情况的估计，选择3个适宜稀 释度，每个稀释度接种3袋。n33.3mL接种法：固体、半固体检样，3袋大纸片接种110稀释 样品各10mL，3袋小纸片接种110稀释样品各1mL ，另3袋小纸 片接种1100稀释样品各1 ml。n3.33mL接种法：液态检样可直接接种小纸片，3袋小纸片接种 原液样品各1ml，3袋小纸片接种110稀释样品各1 ml，3袋小纸 片接种1100稀释样品各1 ml。n封闭袋口保湿，于37
9、培养1820h观察结果（粪大肠菌群应立 即放44.5培养）。大肠菌群快检纸片的种类及其使用方法n3 水用大肠菌群快检纸片（含污水）n组成与性状：每份5袋吸附10ml水样的大纸片（双层1111cm）和10袋 吸附1ml水的小纸片（55cm），干燥纸片为灰白色或淡绿色，加水样 后为青紫色。 n使用方法：根据预计的水样中大肠菌群数确定接种量。n 55.5mL接种法：水样中大肠菌群数量较少时，接种量为 10mL、1mL、0.1mL，即5袋大纸片接种原水样各10ml， 5 袋小纸片接种原水样各1 ml，另5袋小纸片接种110稀 释水样各1 ml。n 5.55mL接种法：水样中大肠菌群数量较多时，接种量为
10、 1mL、0.1mL、0.01mL，即5袋小纸片接种原水样各1ml， 5袋小纸片接种110稀释水样各1 ml，另5袋小纸片接种100稀释水样各1ml。依此类推。n封闭袋口保湿，于37培养1820h观察结果（粪大肠菌群应立即放 44.5培养）。大肠菌群快检纸片法的结果判定n其结果可有如下5种情况：n纸片保持青紫色，无论有无红色斑点或红晕均为阴性。n纸片上出现红点或红晕且其周围变黄，为典型阳性。n整个纸片全变黄色，却无红色斑点或红晕出现，为不典 型阳性，造成此结果的因素很多，见“影响因素” 。n纸片中某部分变黄色，或有或无红斑（红晕），为不典 型阳性。n纸片加样后立即或较短时间内出现黄色或褪色，此
11、情况 应对样品进行中和处理。培 养 18h 阳 性 结 果阴 性 结 果检测结果（实例）干燥纸片加水的纸片计数与结果报告餐饮具或物体表面检测直接报告阳性或 阴性；样品检测根据各不同接种量的阳 性袋数查相应MPN检索表，得到MPN值 。报告方式同传统试管发酵法影响检测结果的因素n1 大肠菌群的菌量，研究证明，菌量的多少与结果 的显示密切相关，同一株大肠杆菌，可因菌量不 同呈现3种不同现象n菌量较大（5376cfu/ml）整个纸片变黄色却 无红色斑点或红晕；n菌量适中（3480cfu/ml而336cfu/ml）整个 纸片变黄，有小而密集的红色斑点或红晕；n菌量较少（240cfu/ml ）纸片可呈青
12、紫色，并 有散在或较密集的红斑点，其周围变黄。影响检测结果的因素n2 水分：湿润纸片时加水过多，使纸片浸透后有剩余 水分，造成细菌在纸片上漂流培养，可出现与“菌量 较大”类似的反应结果，即整个纸片变黄，却无红色 斑点或红晕。水分不够，纸片偏干，影响细菌采集， 且反应结果不鲜亮。n3 培养时间：一般16-24h，不同菌株、不同检样、不 同气温条件，应灵活掌握培养时间，最好观察2次结果 。实验证明，大肠菌群V-P阳性菌株（克雷伯菌和阴沟 杆菌）培养24h后某些菌株可因大量分解蛋白胨产碱使 纸片由黄色逐渐变为琥珀色或灰褐色，失去典型阳性 反应，而大肠杆菌培养36h也无此现象。大肠菌群快检纸片的质量控
13、制n1 感官指标：纸片外观应整洁无毛边，尺 寸标准符合相应规定要求，呈均匀灰白或 淡绿色，加蒸馏水后呈青紫色，无杂色斑 点，无明显变形，无损坏。n2 pH值7.07.4。n3 纸片和内包装应无菌（加无菌蒸馏水 37培养2448h）n4 最小包装铝箔袋应密封。1.0 毫 升 水 样0.1 毫 升 水 样0.01 毫 升 水 样污水大肠菌群检测结果实例（ 36 18h）大肠菌群快检纸片的质量控制n5 特异性试验及指标：n用大肠杆菌3株，沙门菌、志贺菌、金黄 色葡萄球菌各1株的稀释菌液接种于待检 纸片， 37培养1620h观察结果，大 肠杆菌应呈典型阳性反应，沙门菌、志 贺菌可见红色斑点，但纸片无黄
14、色反应 ，金黄色葡萄球菌被抑制 。使用大肠菌群快检纸片的注意事项n1 纸片加样后立即或较短时间内出现黄 色，不是“+”（却易误判为“+” ） ，也不应判为“”。此情况无法用该 纸片检测，原因是由于样品本身呈酸性 ，用化学消毒法处理后的消毒剂残留， 也会使纸片变色或褪色。这种样品应按 样品处理方法处理后再行检测。 使用大肠菌群快检纸片的注意事项n2 采样后样品的正确保存很重要，如保 存不当可使检样中的大肠菌群细菌死亡 或在一定条件下再生长，这些都将影响 检验结果的准确性。检验室接到样品后 ，应立即检验。如因故不能检验时，应 立即置于冰箱内并于2小时内检验。使用大肠菌群快检纸片的注意事项n3 餐饮
15、具或待测物体表面一般用纸片直接采样 ，如气温过高（25以上）又不能及时送 达实验室可适当缩短培养时间。n4 如检测粪大肠菌群，纸片接种后，应立即置 44.5 恒温孵箱培养。防止在常温下放置过久 ，否则将影响检验结果的准确性，因为在此温 度时其他大肠菌群细菌也生长。n5 水样通常都是经氯处理消毒，水中含有一定 量的余氯，使大肠菌群处于受损或受抑制状态 ，在采集水样时应加硫代硫酸钠脱氯，使此受 损的细菌得以复苏与修复，从而避免计数结果 偏低甚至假阴性出现。使用大肠菌群快检纸片的注意事项n6 MPN检索表：MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简 称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，接种 纸片，从规定的反应呈阳性袋数的出现率，用概率论 来推算样品中菌数最近似的数值。n MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释 度，则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标 准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且 结果报告单位也不相同。两 法 对 2 6 0 件 餐 具 的 检 测 结 果 纸 片 法 + - 合 计 试管法 + 2 2 5 0 2 2 5 - 6 2 9 3 5 合 计 2 3 1 2 9 2 6 0欢迎光临指导谢 谢！
