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1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR的原理、操作及其的原理、操作及其 应用应用- - 分子生物学实验技术分子生物学实验技术 系列讲座系列讲座河南农业大学生命科学研究中心张志坤2009.12.7大纲大纲一.原理概述二.操作及结果分析(一).样品制备(二).引物及探针的设计与合成(三).标准品的制备-质粒或纯化后的PCR产物(四).通道的选择及增益的选择(五).标准曲线的建立(六).加样时应注意的细节(七).阈值的选定(八).熔解曲线分析(九).操作流程三.应用(一).绝对定量分析(二).相对定量分析及实验方案(三).SNP检测分析一、原理概述一、原理概述1.Real-Time PCR 1.Rea
2、l-Time PCR 概论概论实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不 仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增 和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。常 规 PCR技术：对PCR扩增
3、反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。一、原理概述一、原理概述2.2.定量定量PCRPCR常用的三个常用概念常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值(1).(1).扩增曲线：反映扩增曲线：反映PCRPCR循环次数和荧光强度的曲线，定量循环次数和荧光强度的曲线，定量PCRPCR仪每次轮仪每次轮PCRPCR扩增都会自动扩增都会自动录荧光强度的变化录荧光强度的变化每个循环进行一次荧光信
4、号的收集一、原理概述一、原理概述2.2.定量定量PCRPCR常用的三个常用概念常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值(2).(2).荧光阈值：荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动手动 设置的原则要大于样本的荧设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，并且保证回归系数大于段，并且保证回归系数大于0.990.99。(3).CT(3).CT值：值： PCRPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值
5、时所经过的扩增循环扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 次数。次数。一、原理概述一、原理概述3.3.荧光定量荧光定量PCRPCR所用的荧光报告基团所用的荧光报告基团 (1).(1).非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： SYBR Green SYBR Green (2).(2).特异性荧光标记：特异性荧光标记： TaqManTaqMan探针探针Molecular BeaconMolecular Beacon分子信标分子信标一、原理概述一、原理概述4.4.非特异性荧光染料非特异性荧光染料-SYBR Green-SYBR Green 的特性的特性(1).SYBR Gree
6、n (1).SYBR Green 能结合到双链能结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位(2).SYBR Green (2).SYBR Green 只有和双链只有和双链DNADNA结合受激后才发结合受激后才发 荧光荧光(3).(3).变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光双链分开，无荧光(4).(4).复性和延伸时，形成双链复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green DNA,SYBR Green 发发 荧光，在此阶段采集荧光信号。荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR GreenSYBR Green一、原理概述一、原理概述4.4.非特异性荧光染料非特异性荧光染料-SYBR Gre
7、en-SYBR Green的工作原理图解的工作原理图解5353 SGNo EmissionSGSGSGExcitati onS G S GS GS GS G S GS G5353Emissi onExcitati on伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBR Green不断的与新增加的基因片段结合 而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。一、原理概述一、原理概述5.5.非特异性荧光染料非特异性荧光染料SYBR GreenSYBR Green的优缺点的优缺点优点：优点：(1).(1).对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性-适用于任何适用于任
8、何DNADNA(2). (2).使用方便使用方便-不必设计复杂探针不必设计复杂探针(3).(3).非常灵敏非常灵敏(4).(4).可做熔解曲线分析可做熔解曲线分析(5).(5).便宜便宜缺点：缺点：(1).(1).对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高(2).(2).与非特异性双链与非特异性双链DNADNA结合，产生假阳性结合，产生假阳性, ,干扰实验的准确性干扰实验的准确性, ,尤其尤其是分析表达量不高的基因时是分析表达量不高的基因时, ,这类情况尤其突出这类情况尤其突出; ; 需要不断的优化反需要不断的优化反应体系应体系, ,降低非特异性扩增降低非特异性扩增. .一、原理概述一、原理概述
9、6. 6. TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针与目标序列互补TaqMan探针的特性：(1).5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等(2).3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)(3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分 开，发荧光(4).Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针一、原理概述一、原理概述6. 6. TaqMan-TaqMan-水解型杂交探针工作原理水解型杂交探针工作原理每扩增一 条DNA分子 ，释放一 个荧光信 号，可以 在循环过 程中任一 点检测荧 光一、原理概述一、原理概述7.7.探针
10、法的优缺点探针法的优缺点(1).(1).极高的特异性和准确性极高的特异性和准确性由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针 序列的特异性，从两个方面保证了所序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异扩增基因的特异 性。性。(2).(2).良好的重复性良好的重复性(3).(3).目前合成价格较贵目前合成价格较贵. .(4). (4).不能做熔解曲线分析不能做熔解曲线分析. .一、原理概述一、原理概述8.荧光定量PCR的数学原理理想的PCR反应：X=X0*2n (扩增效率=1)实际的的PCR反应：X=X0* (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X
11、：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率一、原理概述一、原理概述8.8.荧光定量荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4) Ct= -log X0 + log M (5) log(1+Ex
12、) Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线 性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出 样品中所含的模板量一、原理概述一、原理概述8.8.荧光定量荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量一、原理概述一、原理概述8.8.荧光定量荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理25Sample确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)
13、C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量一、原理概述一、原理概述9.9.认识一下荧光定量认识一下荧光定量PCRPCR仪仪仪器本身的功能：仪器本身的功能：1 1、控制参数（温度）、控制参数（温度）2 2、控制循环数（时间）、控制循环数（时间）3 3、记录整个循环过程中的荧光值的变化，在所有的时、记录整个循环过程中的荧光值的变化，在所有的时间和温度条件下，仪器都会忠实的记录下荧光值的间和温度条件下，仪器都会忠实的记录下荧光值的变化。变化。荧光定量荧光定量PCRPCR仪就是通过对所记录的参数来计算样品的初始模板量的。仪就是通过对所记录的参数来计算样品的初始模板量的。循环数和荧光值曲线温度和荧光值曲线
14、一、原理概述一、原理概述ABI 7300型96孔荧光定量PCR仪， 由于样品间存在光程差，需ROX校正。RoterGene3000型36孔 荧光定量PCR仪，旋转 加热式，不需ROX校正二、操作及结果分析二、操作及结果分析1 1、样品的制备、样品的制备DNADNA样品，主要是样品，主要是DNADNA提取，提取的提取，提取的DNADNA可可TETE缓冲液溶解后缓冲液溶解后-20-20度保存；对于度保存；对于RNARNA样样 品，抽提品，抽提RNARNA后要迅速反转录，将后要迅速反转录，将RNARNA反转录为反转录为cDNAcDNA，TETE缓冲液溶解后可缓冲液溶解后可-20-20度保度保存。存。
15、DNADNA或或cDNAcDNA样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的DNADNA降解，从而降解，从而 影响样品中目的基因的含量。影响样品中目的基因的含量。 对于大量的样品最佳的检测方案是：对于大量的样品最佳的检测方案是：根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是RANRAN立即进行反转录反立即进行反转录反 应，并且将当天反转录的样品进行定量应，并且将当天反转录的样品进行定量PCRPCR检测；千万不可先将所有的样品都提检测；千万不可先将所有的样品都提 取取RNARNA，提取完，提取完
16、RNARNA后再统一反转录，然后在对后再统一反转录，然后在对cDNAcDNA样品进行定量检测，千万不要样品进行定量检测，千万不要 这样做，因为这样做，因为RNARNA是极不稳定的，哪怕是存放于是极不稳定的，哪怕是存放于-80-80度冰箱，一方面度冰箱，一方面RNARNA极其容易极其容易 降解从而影响检测的准确性，另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故障造成停降解从而影响检测的准确性，另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故障造成停 机或停电，那所有提取的机或停电，那所有提取的RNARNA将会很大程度的降解，对样品造成不可挽回的损失将会很大程度的降解，对样品造成不可挽回的损失 ！ 最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量PCRPCR的检测，最大程度的的检测，最大程度的
