微生物实验内容汇总

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1、医学微生物学实验微生物学教研室第一次 实验内容l细菌基本形态观察 （球菌、杆菌、螺形菌）l细菌特殊结构观察 （荚膜、鞭毛、芽胞）l革兰染色法1.细菌的三种基本形态l球菌：葡萄球菌。l杆菌：大肠杆菌。l螺形菌：霍乱弧菌。细菌的三种基本形态示意图葡萄球菌：Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells. 显微镜下的杆菌杆菌(bacillus) Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells弧菌霍乱弧菌Figure 3 - Gram stain of Gram Cholera cells2.细菌

2、的特殊结构观察l芽胞示教片：破伤风杆菌。l鞭毛示教片：变形杆菌。l荚膜示教片：肺炎双球菌。芽孢产芽孢细菌的种类菌体（营养细胞）芽胞破伤风梭菌1000鞭毛变形杆菌鞭毛1000细菌荚膜示意图荚膜的观察：负染色 l【菌种】齿垢l【试剂】生理盐水、结晶紫、碘液、95%乙醇、复 红l【材料】酒精灯、接种环、玻片、3.革兰氏染色法由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。【操作步骤】结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色复红复染涂片固定1 min1 min30 s1 min滤纸吸干，油镜观察结晶紫 1 碘液 1 95% 乙醇 30” 复 红 1 冲洗 滤纸干燥 油镜观察冲洗冲洗冲洗染色初染媒染

3、脱色复染紫色（G）革兰氏染色步骤示意图革兰氏染色甲菌乙菌初染结晶紫媒染碘液脱色乙醇复染复红紫色（G）红色（G-）革兰氏染色步骤示意图【结果】l细菌被染成紫色者，称为革兰氏阳性菌；l而细菌染成红色者，称为革兰氏阴性菌；阳性菌紫色 阴性菌红色【意义】l鉴别细菌，用本法染色可将细菌分成两大类。l了解致病性l指导选择用药【革兰氏染色法的原理 】革兰氏染色法的原理尚未阐明，可能与以下因素有关。1、通透性学说2、等电点学说3、化学学说通透性学说G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚， 脂质含量少，乙醇不易进入。G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄， 含大量脂质，乙醇易渗入。等电点学说G+菌等电点（pI23） G-菌

4、等电点（pI45）在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G -菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料 结合较牢固，不易脱色。化学学说G+菌菌体内含有大量核糖核酸镁盐， 可与碘、结晶紫等染料牢固结合，使 已着色的细菌不易被乙醇脱色G-菌 菌体内含核糖核酸镁盐很少，故 易被脱色注 意 事 项涂片的厚度。固定的程度。染色的时间控制：一一半一。冲洗的方法，不要对着涂片区。95% 乙醇脱色时间。第二次 实验内容一、细菌基础培养基的制备（示教） 二、细菌分离接种技术（操作）平板划线接种法；斜面培养基接种法液体培养基接种法；半固体穿刺接种法 三、细菌在培养基上生长现象（观察） 一、细菌基础培养基制作l液体培养基制作普

5、通肉汤培养基成分：新鲜牛肉浸液100ml，蛋白胨1g，NaCl 0.5g称量，包装，灭菌后使用。l固体培养基制作称取营养琼脂4.5g，加入100ml蒸馏水中溶解 。包装后灭菌使用。l斜面培养基制作 1、称量及溶化2、调pH 3、加琼脂、溶化、定容、（过滤）4、分装、加塞、包扎5、灭菌（6、摆斜面）操作步骤 1. 半固体培养基接种法（操作） 2. 斜面培养基接种法 3. 液体培养基接种法细菌的分离接种接技术（一）分离培养1. 平板分离划线接种法（操作）（二）纯培养平板分离划线接种法连续划线法 分段划线法 IVIII1/5 I1/10 Rotate 90Flame loop Rotate 90Ro

6、tate 90 III1/4 Flame loop平板划线接种法（分离培养法）培养结果132注意事项：1.各区之间接种环要灭菌2.用力适当，不要划破琼脂表面3.注意无菌操作斜面培养基接种法（操作）l用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种 。液体培养基接种法半固体培养基接种法（操作）方法：穿刺接种结果：沿穿刺线生长动力-扩散生长动力+三、细菌在培养基上生长现象沉淀成链生长 浑浊均匀分散生长 菌膜表面生长（需氧菌）1. 固体2. 半固体3. 液体菌落 菌苔动力+ 动力-固体培养基生长现象液体培养基中生长现象沉淀生长沉淀生长混浊生长混浊生长表面生长表面生长半固体培养基中生长现象有鞭毛 动力+无鞭毛

7、 动力沿刺线生长混浊生长培养基生长现象用途固体平板固体斜面液体半固体细菌在培养基上生长现象第三次 实验内容一、细菌分布实验空气中细菌的检查皮肤、日常物品细菌的检查 二、药敏实验一、细菌的分布实验l（1）空气细菌检查材料：培养基，普通琼脂平皿l（2）皮肤（其他物品）消毒前后的细菌检查材料：培养基，无菌生理盐水，75%酒精棉球 ， 2.5%碘酒棉球，无菌棉棒l（3）自来水中的细菌检查材料：培养基，无菌棉棒，酒精灯1. 空气中细菌的检查取三块琼脂平板，将2个打开皿盖 分别置于不同的环境1530min后， 盖好皿盖。另外1个不启盖作为对 照。置37培养1824h。材料：普通琼脂平板方法：结果：计数菌落

8、数，观察菌落数的差异。2、皮肤消毒前后的细菌检查方法l在1个平皿底部做好标记，分为消毒前与消毒后两个区 域。l取一支无菌棉签放入无菌盐水中浸泡，在管壁上挤干 水后擦拭皮肤或其他物品，然后将该棉签涂布于无菌 平皿消毒前区域，作来回划线，注意勿划破琼脂表面 。l将皮肤区域或物品用碘酒棉球及酒精棉球涂擦消毒， 另取一支无菌棉棒用消毒前所述方法取材，接种于标 有消毒后的平皿区域。l平皿37、24h培养后取出观察表面有无细菌生长，比 较消毒前后菌落数目，描述菌落特征。结果：计数菌落数371824h消毒前消毒后自来水中的细菌检查l在1个平皿底部做好标记。l用酒精灯对水管口灭菌，拧开水管开关放水15S。l取

9、一支无菌棉签蘸取自来水，将该棉签涂布于标有消毒前的无菌琼脂平皿表面，作来回划线，注意勿划破琼脂表面。l将平皿于37、24h培养后取出观察平皿表面有无细菌生长，描述菌落特征。二、药敏试验（纸片扩散法）材料：方法：普通琼脂平板(2块平板/组） 大肠杆菌、金葡菌 氯霉素、青霉素、碘酒、结晶紫 大肠杆菌葡菌球菌氯青庆链氯青庆链371824hG+G-l步骤（无菌操作） 1、在培养基平皿上做标记。 2、接种；用棉签分别沾取菌液（G+，G-）均匀 分别涂布于2个平皿上。 3、贴药片；镊子灭菌取药片放置于平皿上的标 记 位置，再灭菌后可取另一药片放置。 4、37，过夜培养，观察结果。药敏实验（纸片扩散法）药敏

10、实验结果药敏实验结果药药敏实验实验纸纸片法抑 菌环环直径青霉素 (10ug/片 )链链霉素 (10ug/片)氯氯霉素 (30ug/片)庆庆大霉素 (10ug/片)敏感标标准抗药药2011 10 12中度敏感21-2812-1410-1713-14高度敏感29 15 17 15白色葡萄球菌 （ G+ ） 大肠肠杆菌（ G - ）第四次 实验内容l病原性球菌标本片观察链球菌、脑膜炎双球菌 l血浆凝固酶试验l抗“O”试验目的要求l掌握病原性球菌的基本形态。l掌握药敏实验操作技术与判断。链球菌脑膜炎双球菌原理和意义致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定

11、葡萄球菌致病性的重要依据。血浆凝固酶试验步骤：血浆 血浆12金葡 白葡 + + 凝集（+）不凝集（-）血浆凝固酶试验生理盐水 + + 无菌操作 ：血浆凝集试验结果l链球菌侵入体内产生SLO，刺激机体产生相应抗体ASO ，当两者中和后，再加入SLO 乳胶试剂，因病人血清 中ASO量很多，未被中和掉的抗体与乳胶试剂反应，产 生清晰凝集，为阳性；无凝集，为阴性。 方法：间接凝集 结果：效价大于400单位 意义：风湿热及其活动性的辅助诊断抗“O”试验（ASO test）原理原理：步骤：抗“O”试验（ASO test）阴性对照（1滴） 待检血清 （1滴）+ +胶乳试剂（1滴） 胶乳试剂（1滴）- ？2m

12、in2min第五次 实验内容l操作：肥达试验l肉毒梭菌、产气荚膜菌标本肥达实验肥达试验（Widal test）是用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原与病人血清做定量凝集试验，以测定患者血清中有无相应抗体，根据抗体含量的多少以及增长情况，可帮助诊断伤寒及副伤寒。 【原理】 肥达反应稀释法示意表试验试验 管（每管0.5ml） 对对照管 1234567生理盐盐水0.50.50.50.5 0.50.5 0.5-1“O”抗原 0.50.50.50.5 0.50.50.52“H”抗原0.50.50.50.50.50.50.53PA抗原0.50.50.50.50.50.50.54PB抗原0.

13、50.50.50.50.50.50.5血清最终终稀释释度 1:401:801:1601:3201:640 1:1280-肥达实验结果判断血清的凝集效价（滴度）：是指能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“+”凝集）的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。 结果判断1、正常凝集效价伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在1：80以下， 伤寒沙门菌“H”抗体在1：160以下，甲、乙型副伤寒沙门菌“H”抗体凝集效价在1： 80以下。 2、病程中动态观察二份血清，第二次效价增长四倍以上有意义 3、O与H抗体在诊断上的意义O H A B 诊诊 断 意 义义（可能）伤寒

14、及副伤寒感染早期/交叉反应伤寒及副伤寒感染晚期/预防接种/非特异性回忆反应伤寒甲型副伤寒乙型副伤寒接种伤寒及副伤寒三联疫苗非肠热症/早期用抗生素/免疫功能低下3、O与H抗体在诊断上的意义肉毒梭菌产气荚膜梭菌第六次 实验内容一、细菌染色标本检查法抗酸染色法（操作） 二、标本片观察：（钩端螺旋体 、白色念珠菌，曲霉、枯草杆菌）l分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸 ，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色 ，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆 菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱 色，故名抗酸染色。l齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红

15、牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当 再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细 菌及背景中的物质为兰色。一、抗酸染色原理抗酸染色l材料：标本：卡介苗染液：石炭酸复红，3%盐酸酒精，美蓝器具：同革兰氏染色实验方法：1、细菌涂片标本的制备涂片 干燥 固定3、油镜观察1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红 2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽 即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免 干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。2）脱色： 3%盐酸酒精脱色301；用水冲洗。3）复染：用碱性美兰溶液复染1，用水冲洗后用吸 水纸吸干。2、染色抗酸染色步骤1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片 干燥 固定抗酸染色步骤l2、染色包括初染、脱色、复染三步。石炭酸复红维持 3-5 3%盐酸酒精30 1 美蓝复染1 冲洗 干燥 油镜观察冲洗冲洗初染脱色复染三、抗酸染色结果抗酸菌呈红色，常