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1、质粒DNA制备一、质粒简介l质质粒是细细菌内独立于染色体并能自我复制 的小环环状DNA分子 l其大小范围从lkb至200kb以上不等。l已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.l这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行 复制和遗传的辅助性遗传单位。 l质粒通过细菌间的接合作用，从雄性体转 移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子l1946年， Lederburg和Fatum发现的F因 子是最早发现的质粒，F因子与高等生物 细胞质中的染色体外遗传单位极为相似。l 1952年，由Lederburg正式命名为质粒 。 l确切地说，质粒是细菌内的共生型遗传 因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予 宿主细胞表型，是比病毒
2、更简单的原始 生命。l质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。通常，质粒含有编码某些酶 的基因，这些酶事实上在一定的环境下对 细菌宿主有利。l由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性、 产抗生素、降解复杂有机化合物，以及产 生大肠杆菌素、肠毒素及限制酶与修饰酶 等等。l质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表 达的重要媒介物，这种基因运载工具在基 因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒 的分离与提取则是最常用、最基本的实验 技术 二、质粒特性1. 分子相对小 l 在5kb左右，质粒较小，比较稳定 ，不易受物理因素的损伤，此外，较 小的质粒一般有较高的拷贝数。2. 含有高效的自主复制成分l质粒的复
3、制与宿主细胞的繁殖不相关，在 抑制细菌蛋白质合成时，细菌染色体DNA 停止复制，但这种质粒可继续利用细菌原 有的酶系进行复制 l质粒含有复制起始点，此起始点及顺式作 用调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌染色体DNA复制所用的同一套 酶系统，在细菌细胞中独立地进行自我复 制及转录。l根据所含复制起始区的不同，有些质粒的 复制与宿主细胞染色体的复制同步，每个 细胞只含有一个或几个拷贝的质粒，即处 于“严密控制”。l有些质粒则处于“松弛控制”，每个细胞 可含达15-20乃至数百拷贝的质粒。这类 质粒在宿主细胞蛋白质停止合成(加入氯 霉素)、染色体DNA停止复制的条件下，拷 贝数
4、继续增加至数千。 3.不相容性l利用同一复制系统的不同质粒不能稳定 地和平共处，可称之为不相容质粒，当 两个上述质粒被导入同一细胞时，它们 在复制及随后分配到子细胞的过程中彼 此竞争。l由于质粒分子是从细胞内的质粒库中随机 选取出来进行复制的，所以两个不同的质 粒在一个单细胞中的拷贝数并不总能保持 相同。最初在随机过程中产生的微小差异 ，将很快导致两种质粒在拷贝数上更严重 地失衡。l在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在 另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒 却占尽上风。细菌生长几代之后，占少数 的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代 中可含有两种质粒中的任意一种，但不会 兼而有之。l通过检查不同
5、质粒在同一细胞中共存的能 力，可以把它们分为若干不相容组。带有 相同复制子的质粒属于同一不相容组，而 带有不可互换成分的复制子的质粒则属于 不同的不相容组。现已发现30多个这样的 不相容组。4. 转移性l在自然条件下，很多质粒都可以通过 一种称为细菌接合的作用转移到新宿 主内。5. 选择的标记l质粒应带有一个或几个可供选择的标 记，便于对转化株的筛选。l常用来作为标记的有氨苄青霉素抗性 (ampicillin resistance，ampr)基因 ，此基因编码内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素的内酰胺环使之 失效，从而赋予细菌抗药性。l另一常用的抗药性基因为四环素抗性 (tetracycline
6、 resistance，tetr)基因， 该基因编码一种含399氨基酸残基的膜相 关蛋白质，能阻止四环素进入细胞。lampr基因或tetr基因若被外源基因插入， 便失去相应应的抗药药性，便于分子克隆的筛筛 选选。 l大肠杆菌的lac Z基因也常被用作为选择的标记 ，此基因编码半乳糖苷酶，能分解一种有色基因 (x)与半乳糖以糖苷键连结成的化合物x-gal。 l 半乳糖苷酶l X-gal X + gall 无色 蓝色产物 半乳糖l l若在含有X-gal的培养剂中，在乳糖操纵 子(lac operon)诱导物异丙硫半乳糖苷 (isopropylthiogalactoside，IPTG)的作 用下，细
7、菌合成半乳糖苷酶，分解Xgal ，此菌落成为蓝色。l若lacZ基因被外源DNA片断插入而破坏， 则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。 6. 限制性内切酶单一切口l在质粒复制子以外的部位具有一种或多 种限制性内切酶的单一切口，便于外源 基因的插入。l若这种单一的限制性内切酶位点处于选 择标记基因的内部，外源基因片断插入 后会导致该基因失活便于筛选。 三、常用质粒载体1. pBR322l pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长 为4 363bp，由3种野生型质粒成分组成， ampr基因来自pRSF2124，tetr来自pSCl01 ，复制起始点来自pM9。核苷酸的序次号 ，以EcoRI序列GAAT
8、TC的第一个T为第一个 核苷酸。 2. pUC系统l如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和 复制子，以及大肠杆菌部分1acZ基因和一 个多种限制性内切酶单一位点的接头构成 ，全长2 666bp，pUCl8和pUCl9所含多位 点接头的方向正好相反。 3表达载体l载体含有tac启动子、Lac操纵基因、 SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等。四、质粒DNA的提取和纯化 （一）、质粒提取的主要步骤 1细菌的培养：l先分离单个菌落， 接种到含少量适当抗 生素的培养基中扩增，随着细菌的生长， 质粒DNA也在自主复制。l对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程 度上受到宿主细胞的控制，故在细菌
9、对数 生长后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白质的 合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制 不受影响而大量扩增。l对于新一代的质粒如pUC系列等，由于宿 主对这些松弛型质粒的复制控制不严，利 用氯霉素对质粒DNA的选择性扩增并不十 分必要。l长时间在氯霉素存在下，质粒DNA合成过 程中，复制链中会掺入核糖核苷酸，对碱 性条件敏感，将会导致大量的缺口环状 DNA和线性质粒的产生 l但有些人仍然偏爱用氯霉素选择性扩增质 粒，其理由是在中等体积培养物中能获取 与大量培养物等同的质粒产量。而且细菌 量的减少，使得裂解物的复杂性和粘稠度 降低，操作更方便、有效，对煮沸法更是 如此。所以使用氯霉素的主要目的，
10、是在 不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培 养体积和细菌的数量 l有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是 由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大 所致。l这种低效率扩增，可利用高营养培养基促 进生长，一般可增加质粒产量4-6倍。 2细菌的收集与裂解l细胞生长过程中，排出大量代谢产物， 为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清 ，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮 ，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应 该仔细去除干净。l细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水 热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶 法等。l不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质 、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种 因素综合后加以选择。 3质
11、粒DNA纯化l 质粒从细菌中分离出来以后，为满足 有些实验的要求还应进一步纯化。CsCl溴 乙锭平衡超速离心法是纯化质粒的可靠经 典方法。l但是由于此法费用昂贵及流程长，近年来 ，发展了几种不同的方法取代了超离法。 如离子交换层析法或排阻层析法，分级聚 乙二醇沉淀法等，也可获得较好质量的质 粒DNA。l转基因动物，真核细胞转染及DNA外切酶 酶切缺失等实验，对闭合环状双链DNA的 要求较高，一般还是用超速离心法纯化质 粒。l对于DNA片段酶切回收，内切酶图谱分析 、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等 实验，直接用小量或中量提取的DNA样品 ，并不需要超速离心纯化，一般可满足实 验要求。（二）
12、质粒DNA的制备l质粒DNA的小量制备 2-5mll质粒DNA的大量制备 500mll碱裂解法 l煮沸法 lSDS裂解法 lTriton-溶菌酶法 （三）质粒DNA提取方法的选择 l常用的煮沸法，碱法,SDS法均可获得较满 意效果至于有人采用碱法提取小量细菌 培养物的质粒， 用煮沸法或SDS法进行质 粒DNA的大量分离， 只是各个实验室的习 惯问题.l但是对于不同的菌株和不同大小的质 粒DNA分子及以后进行的不同实验等具 体情况，选择哪种方法制备质粒DNA， 应考虑以下因素：1菌株类型l 大量提取HB101，TGl菌株中的质粒 不提倡选择煮沸法，这类细菌富含糖 类，在煮沸或去污剂裂解细菌时，大
13、量 释放出来。l若用CsCl-EB梯度平衡超速离心， 糖 类的密度平衡区域与闭环共价质粒DNA 带非常邻近，在抽取闭环质粒DNA时， 不可避免地污染有糖类，它们可抑制许 多DNA限制性内切酶的活性。l另外，HB101及其它含有endA+基因型 的菌株表达中的核酸内切酶A，在煮沸 时不能完全失活， 在以后操作中， 只要有Mg2+存在(如内切酶反应缓冲液) ，核酸内切酶A就可将质粒DNA降解， 而影响实验结果。l若一定要用煮沸法提取这类菌株的质粒 DNA，不管是大量还是小量制备，必须 用酚、氯仿反复抽提几次以去除该酶 2质粒的大小l 大于15kb的质粒DNA易被强烈的物理 或化学作用损坏，所以常选
14、用操作过程 较温和的SDS法。细菌悬浮液中含有 10%蔗糖以提高溶液的渗透压，减轻细 菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切 力。l在溶菌酶消化细菌壁与膜后，再加SDS 解聚蛋白质与DNA的结合。l整个操作中物理剪切力小， 适用于大 分子量的质粒DNA的提取。3细菌染色体DNA变性条件强弱的控制l 碱法是目前实验室中最常用的质粒 DNA提取方法。它对细菌的裂解，细菌 染色体DNA及蛋白质变性充分，所以提 取的质粒DNA产量高纯度好。l但是暴露在强碱性环境中时间过长， 共价闭合环状质粒DNA可发生不可逆的 变性，导致内切酶切割困难，质粒DNA 迁移速度降低1倍左右，EB染色效率低 。l1966年V
15、inograd等人对这个问题作过 报道，但目前，仍有些实验人员，对 这一关键问题并没有足够的重视。如 出现这种状况，在下次提取时，可以 适当缩短碱变性时间，不必按某些书 籍中规定的10分钟时间操作l l在煮沸法中，过长时间，过高热度也 会导致类似问题的出现，这种影响实 验结果的操作细节应根据具体的菌株 和质粒情况加以适当改进。4细菌的培养与收集l 细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细 胞壁成分，也会影响到质粒的质量和内切 酶酶解效果。所以离心收集细菌时，上清 液应去除干净，最好用STE或生理盐水再 悬浮，漂洗菌体1-2次。 （四）碱裂解法原理：l在pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的大 分子
16、量细菌染色体DNA变性，而共价闭 环(CC)质粒DNA仍为自然状态。l将pH调至中性并有高盐浓度存在的条 件下，染色体DNA之间交联形成不溶性 网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污 剂SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒 DNA仍然为可溶状态。l通过离心，可去除大部分细胞碎片染 色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在 上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯 化质粒DNA。问题：l）有些工作者首次进行小量制备时 ，有时会发现质粒不能被限制 酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉 淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时 注意得不够。l大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进 行抽提可以去除小量制备物中的杂质 。如果依然存在，可用离心柱层析法 纯化。l）在十分偶然的情况下，个别小量 制备物会出现无质粒的现象。 这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同 乙醇一起被弃去。
