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1、 一、概述利用微生物技术，通过高度工程化的新 型综合技术，以利用微生物反应过程为基础 ，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖 及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化 进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物 产品的生产。绪论二、抗生素的发展史u 我国早在宋朝真宗（998-1022）年代就开始利用 接种人痘的免疫技术预防天花病。u 1796年英国医生E.Jenner利用接种牛痘苗预防天 花并获得成功。u1929：Fleming在葡萄 球菌培养皿中，污染的 霉菌周围出现透明的抑 菌圈。 u杀菌物质，断言太不稳 定，无法分离并用作药 物。 u1939：牛津病理家 Howard Florey，化学 家E
2、rnst Chain， Norman Heatley.发酵 瓶培养霉菌，培养里提 取测活性，青霉素结晶 。u1940:8只注射链球菌， 提取物对4只治疗。未经 治疗鼠在24小时内死亡 ，治疗鼠存活数天至数 周。 u1941年2月开始治疗第一 批人类病人。 u1943：威斯康辛大学小 组，取得突破 u生产菌表面培养：几十 个单位 u深层培养产黄青霉： 100U/ml uX、UV诱变育种：1000- 1500U/ml u不产色素变种：66000- 70000U/mlu1941年，美国辉瑞制药公司开始介入青霉素的试验性 生产，使用了生产柠檬酸已经非常成熟的通入无菌空 气并进行搅拌的深层发酵法。这种方
3、法给发酵工业带 来了革命性的变化。自此以后制药业走进了抗生素时 代 u我国微生物发酵制药工业起步较晚，1953年，我国第 一家青霉素生产厂上海第三制药厂才建成投产。 u1958年，我国最大的抗生素制药企业华北制药厂在 石家庄建成投产，主要产品为青霉素、链霉素、土霉 素和红霉素等。三、抗生素药物的分类抗细菌：青霉素、红霉素、四环素 抗真菌：两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素抗肿瘤：丝裂霉素、诺卡霉素 抗病毒：阿糖腺苷、金刚烷胺四、微生物发酵研究范围 微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生 产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括微生 物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工艺 等。 主要讨
4、论用于各类药物发酵的微生物来源和改造 、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺与主 要参数的确定、药物发酵过程的优化控制、质量控制 等。第一章 微生物药物的产生菌常见的制药用微生物细菌放线菌真菌细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)放线菌抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia)生产利福霉素、蚊霉素等放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora)多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora)产庆大霉素。放线菌之游动放线菌属 （ Actinoplanes）典型代表：济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinan
5、esisn)产创新霉素(creatmycin；1964)真菌之曲霉属(Aspergillus)生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗 生素，进行甾体转化。真菌之青霉属(Penicillum)产黄青霉(Penicillum chrysogenum)生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸真菌之头孢霉菌属 (Cephalosporium)产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)都生产头孢菌素C第二节 制药微生物的育种菌种选育菌种筛选菌种保藏菌种的退化和复壮一、发酵菌种的选育要求生产力：能在
6、廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素发酵菌种的选育方法从自然界中获得新菌种诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程（1）从自然界中获得新菌种u土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等u基本程序：采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株（2）诱变育种物理或化学方法诱发突变物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等u杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传 物质得以交换u原生质体融合育种
7、：借助原生质融合技术实现 遗传物质的交换u基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种 ，技术含量高，应用面广二、菌种筛选（1） 随机筛选摇瓶筛选法、琼脂块筛选法 （2）理性化筛选筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选营养缺陷型突变株三、菌种保藏(Culture conservation)目的：保证菌种经过较长时间后仍保持 生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生 理形状尽可能不发生变异。原理：根据微生物的生理、生化特性，人工创造 条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使微生物 代谢活动处于不活泼状态，使其存活且得以延续。在 进行保藏时最好是选用菌种的休眠体，如芽孢、孢子 。通过保藏可以减少微生物的
8、新陈代谢，降低菌种变 异的几率。菌种保藏三要素典型菌种的优良纯种的休眠体；创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。菌种保藏的常用方法斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法方法名称主要特点适用范围保藏期斜面低温保藏法传代培养，4保藏各种微生物的短期保藏。1-6个月石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温 或4保藏各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。1-2年砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器 中抽真空，室温或4保 藏产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干
9、燥敏 感的微生物1-10年麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4 保藏产孢子霉菌和某些放线菌， 工厂多采用此法1年甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中， 需低温冰箱基因工程菌1年/10年冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快 速冻结，减压抽真空， 需冻干机各类微生物5-15年液氮超低温保藏法保护剂，超低温（- 196），需超低温液氮 设备各类微生物15年以上宿主保藏法与培养基混合直接低温 保存专性活细胞寄生微生物（如 病毒）u菌种保藏机构ATCC（美国典型菌种保藏中心）CMCC (中国医学微生物菌种保藏管理中心)NBRC (日本技术评价研究所生物资源中心)四、菌种的退化和复壮退化：基因突变连续传代环
10、境不良或污染 了杂菌生产能力下降 抵抗不良环境条件 能力减弱复壮纯种分离粗放、精细寄主复壮选择合适的培养条件改变营养成分、酸碱度、培养温度第二章 培养基 第一节 培养基的成分原则：根据菌种特性、微生物生长发育阶段、发酵产物 特点等因素合理配制使用不同成分及配比的培养基，为 微生物提供适宜的营养物质，以满足菌体生长和合成产 物的需求。一、碳源工业常用：糖蜜（营养丰富，物美价廉）玉米淀粉及其水解液（克服葡萄糖代谢过快的弊病）油脂（消除泡沫）糊精第一节 培养基的成分二、氮源 有机氮源：黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、 鱼粉无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水三、无机盐和微量元素磷（链霉素、四环素
11、） 硫（青霉素、头孢菌素） 铁（青霉素、四环素、麦迪霉素） 镁（卡那霉素、新生霉素、链霉素） 锌（链霉素、青霉素） 氯（金霉素、灰黄霉素）四、前体前体是指加入到发酵培养基中的能够直接被微生 物在生物合成过程中结合到产物分子中去而自身结构 没有显著变化的一类小分子物质。注意：少量多次五、促进剂和抑制剂促进剂是指那些既不是营养物质又不是前体却能 提高产物产量的添加剂。抑制剂是指在发酵过程中会抑制某些代谢途径的 进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所 需的某种产物或是正常代谢的某一代谢中间产物积累 起来。六、生长因子那些对微生物生长不可缺少的微量有机物质，微 生物不能通过普通的碳源、氮源合成
12、这些物质，需另 外添加，包括维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱及其 衍生物。第二节 培养基的类型类别：按组成成分分合成培养基：成分明确、稳定，多用于研究和育 种，不适合大规模生产。天然培养基：天然动植物产品，营养丰富、价格 低廉、适于工业生产。按培养基的物理状态分 固体培养基：适合菌种的培养和保存半固体培养基液体培养基：适合发酵工业大规模使用按培养基的生产用途分孢子培养基供菌种繁殖孢子用的，常采用固体培养基。条件：培养基营养不要太丰富无机盐浓度适当培养基的PH值要适中常用：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、 玉米培养基二、种子培养基种子培养基是供孢子萌发和菌种生长繁殖用的培 养基，营养成分要比较
13、丰富、完全、易被菌体利用。营养成分：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵 母粉、硫酸铵等。三、发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物用的 培养基。注意：碳氮源速效和迟效的相互搭配，少用速效 营养，多加迟效营养，比例适宜。第三节 培养基的设计与选择 一、培养基的设计遵循的原则：1、营养物质满足微生物生命活动的需要2、营养物质的浓度及配比适当3、PH值适宜4、符合培养的目标5、原料来源广泛，价格合理二、培养基的选择 1、液体培养基和固体培养基的选择液体培养基：种子培养及大规模发酵生产。固体培养基：微生物菌种的分离、纯化及保存、 菌落特征鉴定、活细胞数目测定2、根据微生物的营养特点选择培养基3
14、、依据生产实践和科学实验的要求选择培养基4、考虑培养基的成本选择原则：产物或菌体得率大的降低产品的分离提纯成本生产能力最高的副产品生成最少原料质量稳定，供应充足工艺过程较易进行第四节 影响培养基质量的因素一、培养基组成配比的影响 二、培养基原材料质量的影响 三、水质的影响 四、灭菌的影响 五、其他因素的影响一、培养基组成配比的影响氮源过多：菌体生长旺盛，PH值偏高，不利于代谢产 物积累。 氮源不足：菌体繁殖量过少，影响产量。 碳源过多：PH值偏低。碳源不足：易引起菌体衰老和自溶。二、培养基原材料质量的影响有机氮源（黄豆饼粉、玉米浆）、配制培养基（蛋白 胨）、碳源（油脂）消除原则：在工业生产中必
15、须严加控制，按质量标准 进行分析检验，合乎标准的原材料方能使用。三、水质影响孢子培养基用蒸馏水货深井水，种子培养基、发 酵培养基用深井水或自来水，发酵生产中有的使用地 表水，但是必要时要经过适当处理才能使用。四、灭菌的影响严格控制灭菌操作，力求达到既灭杂菌又减少营 养成分的损失，对那些易降解或易发生化学反应的组 分应单独灭菌。五、其他因素影响 1、培养基的PH值培养基PH值的调节应主要通过改变培养基营养物 质的浓度比例，特别是生理酸、碱性物质的用量来完 成。少量培养基的PH值可用缓冲液加以缓冲。 2、培养基的黏度黏度适宜第三章 灭菌第一节 灭菌的原理和方法灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉
16、物料 及设备中所有生命有机体的过程。一、常用的灭菌方法化学物质灭菌辐射灭菌过滤介质灭菌加热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）1、化学物质灭菌试剂：甲醛、苯酚、高锰酸钾、新洁尔灭、乙醇、 过氧乙酸、漂白粉等。适用范围：生产环境或小型器具。不适用于培养基 的灭菌。2、辐射灭菌用于灭菌的射线包括紫外线、X射线、射线，其 中以紫外线最常用。紫外线主要用于无菌室、培养间等空间的灭菌。3、过滤介质除菌主要用于澄清液体及气体的除菌4、加热灭菌（1）干热灭菌火焰灭菌：主要用于金属接种工具、试管口、锥形瓶口、接 种移液管和滴管外部及无用的污染物或实验动物的尸 体等灭菌。金属小镊子、小刀、玻璃涂棒、载玻片、盖玻片 灭菌时，应先将其浸泡在75%酒精溶液中，使用时从 酒精溶液中取出来，迅速通过火焰，瞬间灼烧灭菌。热空气灭菌生产上常用的灭菌条件为160-170、1-1.5h。（2）
