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1、 目目 录录 1 普萘洛尔治疗婴幼儿增殖期血管瘤的实验研究1 1.1 中文摘要3 1.2 英文摘要5 1.3 前言7 1.4 1.5 1.6 材料与方法9 结果17 讨论22 1.7 结论26 1.8 参考文献27 1.9 英汉缩略词对照表30 2 致谢21 3 普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的研究进展（综述）32 普普萘洛尔萘洛尔治疗婴幼儿增殖期血管瘤的实验研究治疗婴幼儿增殖期血管瘤的实验研究 摘要摘要 目的：目的： 探讨普萘洛尔对婴幼儿增生期血管瘤的治疗作用及可能机制。方法：方法：用手术切除的婴幼儿血管瘤新鲜组织块移植于裸鼠，建立血管瘤动物模型；于移植后第 45 天，将移植瘤组织均成活的实验裸鼠
2、 22 只分为 2 组：组 1(普萘洛尔治疗组)，组 2(生理盐水对照组)，每组 11 只，分别应用普萘洛尔和生理盐水治疗干预，观察比较移植瘤的生长情况；在首次药物干预后的第 15 天，将实验裸鼠用颈椎脱臼法处死，切取移植的瘤体组织。免疫组化法检测移植瘤组织中血管内皮细胞 MVD 值，CD34，Ki-67，Bcl-2，VEGF 的表达情况，TUNEL 法检测移植瘤组织中细胞的凋亡情况；酶联免疫吸附法检测 cAMP 浓度及 PKA 活性的变化。结果结果：1.药物干预后的 l 周、2 周，普萘洛尔组与生理盐水组比较，两组移植瘤的体积出现显著差异(P8个红细胞直径的血管不做计数，以及分辨不清或染色模
3、糊的细胞也不做计数。 4.7.2 Ki-67、VEGF、Bcl-2阳性判定：Ki-67阳性表达是瘤体细胞核内有棕褐色颗粒出现； VEGF阳性表达是瘤体内皮细胞膜或胞浆内有棕黄色颗粒出现； Bcl-2阳性表达是瘤体细胞胞浆内有棕黄色颗粒出现。 标本切片每张随机选取5个400倍镜视野，计数视野中的阳性细胞数(100个细胞内)，将其总数除以5，再乘以100%，算出该标本的阳性指数。 VEGF表达分级标准为： 阳性细胞数50(+)10。 4.7.3 TUNEL法检测阳性表达为细胞核内有棕黄色颗粒出现。标本切片每张随机选取5个400倍镜视野， 计数视野中的阳性细胞数(100个细胞内)，将其总数除以5，再
4、乘以100%，将其总数除以5，再乘以100%，算出该标本的凋亡指数(AI)。 4.7.4 cAMP浓度判定：以光密度(OD)值为纵坐标，各级标准品浓度为横坐标，绘制出标准曲线，根据样本的OD值查出其浓度，再乘以稀释倍数，即为样本的实际浓度,cAMP浓度用pmol/ml表示。 4.7.5 PKA活性判定：以各级标准品吸光值为纵坐标，ngassay为横坐标，绘制出标准曲线，根据样本的吸光值查出ngassay，再乘以稀释倍数，即为样本PKA的活性，PKA活性以ngassay表示。 4.8 图像采集分析 标本使用NikonE 600研究显微镜，图像采集使用SPOT Cool CCD摄像头拍摄，图像分析
5、使用Image-Proplus 5.0版本的专业图像分析软件进行。将每个标本做5张切片，图像采集时每张切片需随机选取5个400倍视野。 4.9 统计学处理 数据处理采用SPSS15.0统计软件进行统计学分析， 计量资料用均数标准差xs表示，组间指数采用t检验以及直线相关性分析，检验水准设定0.05，P0.05)。药物干预后的l周、2周，两组移植瘤的体积出现明显差异(P0.05 表 3 普萘洛尔与生理盐水组Bcl-2，细胞凋亡指数(AI)比较 组别 例数 Bcl-2 AI 普奈落尔组 22 7.971.08 71.836.75 生理盐水组 22 40.313.14 10.933.84 注：与生理
6、盐水组比较 P0.05 3 3 酶联免疫吸附法检测酶联免疫吸附法检测 3.1 cAMP浓度检测：普萘洛尔组的cAMP浓度为6.631.76pmol/ml明显低于生理盐水组14.374.55pmol/ml，两组间明显差异明显(P0.05 图 1 治疗两周后,普萘洛尔与生理盐水组移植瘤情况。 治疗两周后，普萘洛尔组a a瘤体明显缩小，瘤体组织颜色发白，血供较差；生 理盐水组b b瘤体缩小不明显，瘤体颜色鲜红，血供良好。 图 2 治疗两周后，普萘洛尔组与生理盐水组瘤体组织HE染色情况。(HE400) 治疗两周后，普萘洛尔组 a a 瘤体组织血管内皮细胞稀疏分散，管壁变形、塌陷， 管腔破坏； 而生理盐
7、水组 b b 瘤体组织毛细血管增生丰富， 血管壁及管腔结构良好。 图 3 各组的免疫组化染色情况。(SP400) 普萘洛尔组与生理盐水组CD34表达均为阳性，但普萘洛尔组(A)CD34表达明显 低于生理盐水组(B)。 普萘洛尔组Ki-67(C)表达明显低于生理盐水组(D)。 普萘洛尔组Bcl-2(E)表达明显低于生理盐水组(F)。 普萘洛尔组VECF(G)表达明显低于生理盐水组(H)。 讨论讨论 血管瘤是婴幼儿时期最常见的良性血管肿瘤，发生率达11211。对于面积巨大、生长迅速且不能消退的血管瘤，不仅可引起感染、溃疡、出血等症状，影响受累器官的功能，还可因容貌畸形使患者承受带巨大精神压力。因此
8、，对于影响容貌及机体功能甚至危及生命的血管瘤，需积极治疗。其治疗包括药物治疗、激光治疗、放射性核素治疗、冷冻治疗、血管瘤铜针疗法及手术切除等，其中最常用的治疗方法是药物治疗12。干扰素a、抗癌类药物、皮质类固醇激素等都是传统的治疗药物。这些药物治疗效果不确切，尚有不同程度甚至较严重的不良反应。因而，寻找对婴幼儿血管瘤更安全更有效的治疗药物或方法，成为多年来临床医师奋斗的目标 1 1 普萘洛尔对幼儿血管瘤的治疗普萘洛尔对幼儿血管瘤的治疗 法国医生Laut-Labrze在为1例阻塞性肥厚性心肌病并伴有严重的鼻腔毛细血管瘤的患儿应用降血压药物普萘洛尔治疗时， 意外发现经治的血管瘤好转，最后血管瘤几乎
9、完全消失。以后有意识地选用普萘洛尔治疗不同部位的难治性毛细血管瘤共11例， 均收到了意外的良好效果，并于2008年1首次予以了报道。这是一个极其偶然但意义重大的发现，为婴幼儿血管瘤的治疗提供了新的方法。 CD34又称人原始造血细胞抗原，是一种单链穿膜蛋白，常用来标记血管内皮细胞，与其他抗原相比，其抗原特异性是最高的13。本实验将幼儿增生期血管瘤移植到裸鼠皮下， 移植瘤组织经CD34检测均呈阳性， 说明被检瘤体组织均来源人体， 并非来源于诱发的裸鼠血管瘤，此模型保持了人体血管瘤的生物学特性， 能客观真实的反映药物对血管瘤的治疗作用。近年来，在研究肿瘤新生血管时，常采用CD34来标记血管内皮细胞，
10、 CD34与大血管的内皮细胞不发生反应，而与肿瘤内的新生血管反应强烈，它反映了肿瘤血管的生成，并用MVD来计数。在本实验中，正是以MVD来计数CD34的阳性指数，药物干预后，普萘洛尔治疗组MVD值明显低于生理盐水组(P2.5个月的1.5 mg/kg，2.5个月的1mg/kg，1次/d顿服，用药方便且安全有效。詹明坤、金云波等35、36在治疗血管瘤患儿时，首次用药剂量为1mgkg， 并在3天内逐渐将剂量加至常用量2mgkg/d，2次/d，治疗一般维持到患儿l岁后或病变完全缓解。用药前必须完善血糖、血常规、 、心肌酶、肝肾功能、心脏彩超、心电图等检查，排除心脏疾病及气道高敏感性疾病；用药过程中密切
11、观察患儿的生命体征及一般情况。 3.3.3 普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的不良反应 从普萘洛尔开始应用于婴幼儿血管瘤的治疗， 至今国内外尚未出现关于普萘洛尔严重不良反应或致死的文献报道。Love和Sikka等37报道，经普萘洛尔治疗的6岁以下血管瘤患儿，未见1例与普萘洛尔相关的严重不良反应和死亡。 虽然应用普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤相对比较安全，但仍有文献报道32、38，部分患儿应用后出现心力衰竭、心动过缓、低血压、低血糖、高血钾、肝脂酶升高、支气管痉挛、暂时性呼吸窘迫、睡眠障碍、多汗、疲乏、烦躁不安、胃肠不适、腹泻、皮疹等。如果患儿在治疗的过程中出现上述不良反应，应及时减少剂量并对症处理，若患儿仍
12、不能耐受，则须立刻停药。在普萘洛尔治疗的过程中要注意不良反应的发生，并做好预防工作，对患儿进行长期随访，全面了解普萘洛尔的安全性及远期作用。 3 3 总结与展望总结与展望 目前，应用普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤已成为一种新疗法，是血管瘤治疗史上的革命性创新，在治疗实践中，已证实了其美好的应用前景，为血管瘤的治疗指明了方向。 然而普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的适应证、 用药剂量、 用药间隔、用药周期、最佳给药途径以及最佳治疗时间都没有统一标准，各国学者的治疗均是根据各自的临床经验总结，缺少系统性依据，需要大型的临床试验进行检验确认。尤为重要的是，普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤的作用机制尚不明确，势必会影响普萘
13、洛尔大范围的推广应用。目前关于普萘洛尔对婴幼儿血管瘤的治疗， 国内外正在进行几项随机双盲对照试验39， 相信随着实验研究的深入， 将使普萘洛尔的用药剂量、用药时间、不良反应及疗效等研究进一步向前推进。 参考文献 1. Cheung DS， Warman ML， MulIiken JB Hemangioma in twinsJ Ann Plast Surg，1997，38(3)：269 2. Drolet BA，Esterly NB，Ffieden UHemangiomas in cllildrenJN End J Med，1999，34l(3)：173-181 3. Jacobs AH ， w
14、alton RG.The incidence of birthmarks in the neonateJPediatrics，1976，58(2)：218-22 4. Mulliken JB, Glowacki J. Hemangiomas and vascular malformations ininfants and Children: a classification based on endothelial characteristics J. Plast Reconstr Surg, 1982,69(3)：412-422. 5. Yu Y，Flint AF，Mulliken JB，e
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