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1、本实验主要是采用新型的介孔碳材料作为固载酪氨酸酶的检测平台构建生物传感器，应 用于水体环境中苯酚污染物的检测，并通过高效液相色谱法对电化学酪氨酸酶生物传感 器法的准确性进行了评价。研究表明，介孔碳的“空间间限制效应应”能够防止酪氨酸酶（三 维尺寸为6. 5 nm x 9. 8 nm x 5. 5 nm)体外去折叠失活。基于介孔碳材料构建的电化学酪氨 酸酶生物传感器在苯酚污染物检测方面显示了优良的性能，其重现性、灵敏度、稳定 性、选择性以及检出限均比较令人满意。基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器对苯 酚污染物的检出限达到20 nmol/L，线性范围0.1-10mol/L。采用基于介孔碳的电化学
2、酪氨 酸酶生物传感器和高效液相色谱法对实际 水产品进行测定结果比对，结果表明该生物 传感器方法检测结 果准确、有效，适合于苯酚污染物突发污染事件的应急检测。基于介孔碳的电化学酪氨酸酶生物传感器测定水体中的苯酚 及高效液相色谱法评价介孔碳是一类新型的非硅基介孔材料，2nm孔径50nm,具有巨大的比表面积（可高达2500m2/g）和孔体积（可高达2.25cm3/g），非 常有望在催化剂载 体、储氢 材料、电极材料等方面得到重要应用，因此受到人们的高度重视。此外介孔材料制得的双电层电 容材料 的电荷储量高于金属氧化物粒子组装后的电容量，更远高于市售的金属氧化物双电层电 容器。空间间限制效应应：镶嵌于
3、介质中的半导体纳米颗粒，当它们的尺寸为量子尺寸(即可以与半导体块材料中束缚激子的玻尔半径相比较) 时，存在着对电 子结构的空间量子限制效应。这种效应表现在三个方面3：第一，在接近布里渊区中心处，不存在价带或导带 ；第二，空间限制项加在带能量上，块材带隙光学吸收和带-带跃 迁大大地减少；第三，电子和空穴的波函数总是在相当大的程度上 交迭着，且可因库仑 相互作用而形成激子。激子的运动除了受到半导体纳米晶体本身的空间量子限制之外，还受到周围介质的势垒 的限制作用(总称量子限制效应作用)。苯酚是一种常见的工业污染物，主要来源于炼焦、炼油、造纸等生产过程中排出的 废气和废水。苯酚可经呼吸道、消化道和皮肤
4、侵人人体，与细胞原生质中的蛋白质结合 ，使细胞失去活力。苯酚还对神经、泌尿、消化系统有毒害作用。苯酚是环境中广泛存 在的一类优先控制有机污染物，不仅具有毒性，还具有内分泌干扰效应。苯酚污染物严 重威胁饮用水安全和人类健康，对苯酚污染物进行检测是饮用水安全评价的一项重要指 标。我国生活饮用水卫生标准(GB 5749-2006)规定饮用水中挥发性酚类似苯酚计)不能超 过 0. 002 mg/L。存在于饮用水环境中的这些苯酚污染物严重威胁着生态安全和人类健 康。所以需要发展高灵敏度、高选择性的检测方法，从而能够及时筛查 出环境中的苯酚 污染物并及时采取补救措施。目前常用高效液相色谱(HPLC）等方法
5、对苯酚污染物进行定 量检测。此类分析方法的准确度较高，但是操作复杂、耗时并且仪器设备笨重、分析成 本高，不适于大量环境样品的快速筛查。因此急需发展灵敏、经济、便捷的能够筛查水 体环境中的苯酚污染物的新方法。酪氨酸酶（三维维尺寸为为6.5 nm x9. 8 nm x5.5nm)生物传传感器是催化氧化苯酚的核心部件 ，同时酪氨酸酶也是一种生物活性蛋白质(体外易失活) 。酪氨酸酶易失活的特性决定了 必须要有一个对酪氨酸酶分子生物相容性较好的固定材料来提供一个有利的微环境，以 保持其生物活性和稳定性，同时要求这个固定基底具有较好的电化学换能力（导电性) 和高的酶载量以提高生物传感器的灵敏度和检出限。因
6、此，电化学酶基生物传感器发展 的核心是传感材料，性能优良的固定材料能够显著提高酶的体外稳定性和生物活性。电 化学酪氨酸酶生物传感器是一种非常有应用前景的苯酚污染物检测方法。其对苯酚的检测原理是:电化学酪氨酸酶生物传感器能够利用分子氧催化苯酚生成邻苯酚 和邻苯醌，而邻苯醌又可以在电极表面通过电化学催化还原生成邻苯酚形成信号循环放 大。有序介孔碳具有可控的孔结构和孔径大小。大的比表面积和孔体积、良好的导电 性、好的电化学稳定性，可以作为酪氨酸酶的理想固定基底。本研究将酪氨酸酶分子诱陷到合适孔径大小的介孔碳材料中，并由此构建了基于介孔碳 材料的酪氨酸酶生物传感器。研究结果发现，当介孔碳直径与酶分子大
7、小相匹配时，利 用介孔碳的空间间限制效应应，可防止酶分子的去折叠失活，提高酶的长期稳定性和生物活 性;同时酪氨酸酶分子与导电基底之间由于距离较近而减少了长程电子传输，利于电化 学能转化。介孔碳多孔的网络骨架结构还可以为酪氨酸酶反应的底物和产物提供通畅的 通道，提高传感器的响应速度和灵敏度。此外，介孔碳材料优良的电化学换能能力和高 的酶载量能够满足环境中酚类检测对 酪氨酸酶生物传感器在灵敏度和检出限等方面的要 求，达到快速检测环 境样品中苯酚污染物的要求。本研究采用高准确度的（HPLC）对电 化学酪氨酸酶生物传感器检测结 果的准确性、可靠性进行了评价。1.1材料与试剂壳寡糖和酪氨酸酶(酶活力大于
8、1 000 /mg,等电点5. 92)都购自美国西格玛公司，甲醇(色 谱纯)购自德国默克公司，苯酚和其他所有试剂都购自天津科密欧公司。整个实验过 程中 采用的水均为Milli-Q水(电阻率18 Mcm）。如果没有特殊说明，电化学实验过 程中的 电解质溶液均采用50 mmol/L的磷酸盐缓冲液争（PH 7. 0)。酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指妹催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示 ，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际 就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间 内、单位体积中 底物的减少
9、量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确 检测 ，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为 合适。 这里单位是每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是u/mg。活力越高则酶越纯。1.2实验仪 器透射电镜(TEM, JEM-2000EX，日本);高效液相色谱仪(按捷伦1200，配二极管阵列检测 器，美国);物理吸附仪(康塔SI4，美国);CHI 440 B电化学工作站（上海辰华公司);三电极体 系:玻碳电极（GC)为工作电极，Ag/AgCI为参比电极（KCl浓度3 mo
10、l/L），铂电极为对电 极;超声波清洗器。实验部分1.3 10 nm孔径介孔碳材料的制备本研究以采用溶胶-凝胶法制备的直径为10nm的单分散硅球作为硬模板，然后以苯乙烯 为碳源，经惰性气氛下的高温催化碳化一去除模板等步骤后，获得10 nm孔径的有序介孔 碳。步骤一在100 mL的三颈烧 瓶中加人0. 0292 g L-赖氨酸、27. 8 mL去离子水以及4 mL的正硅酸乙酯，在70下磁力搅拌反应12 h，于80缓慢蒸 干溶剂，得到直径为10 nm的纳米硅球。步骤二在石英研钵中研细上述硅球，然后向模板硅球中加人Ni(NO3)26H20的乙醇水溶液(乙醇/水的体积比为1: 1），最终使Ni与Si的
11、物质的量 比为1:34。步骤三然后将浸渍过 Ni(NO3)26H20的SiO2模板在80烘箱中干燥，然后在红外压片机上压成厚1mm的薄片（压力6 Mpa）步骤四向10 mL新鲜蒸馏的苯乙烯单 体中滴加0. O5 mL浓硫酸，使苯乙烯初步聚合;取1g浸渍Ni(NO3)2的SiO2模板置于25mL钳祸 中，加人5 mL初 步聚合的苯乙烯，于160预碳化24 h，然后将SiO2 / C的复合物移人管式炉中，在高纯氮气保护下升温至850热解3h，升温速率为5 /min。步骤五热解结束后将复合物冷却至室温，在20%氢氟酸溶液中搅拌12 h去除SiO2 ，过滤 、洗涤后干燥，得到孔径为10 nm的介孔碳材
12、料。步骤六将制备得到的纳米硅球（模板)和介孔碳材料进行透射电镜 表征。采用物理吸附仪表征介孔碳材料的氮气吸附一脱附等温曲线和孔径分 布。测定之前，需要将介孔碳样品于180脱气6 h。介孔碳材料合成的具体步骤:麂皮是一种野生动物麂的皮，粒面伤残较多，比羊皮厚实，纤维组织 也较紧 密，是加工绒面革的上等皮料。麂皮现己很少用，现多用优质 山羊 皮，绵羊皮，鹿皮代替，经油鞣法制成的清洁用革，质地相当柔软,对于硬度不高的玻璃或者是其他东西相当有保护性.而这种麂皮又分为生麂皮 和熟麂皮,生麂皮一般用来擦拭汽车中的玻璃或者是反光镜的。1.4基于介孔碳材料的电化学酪氨酸酶生物传感器的构建首先将玻碳电极分别在含
13、粒径1、0.3、0.05m氧化铝微球的麂（j)皮上打磨，然后用去离 子水和无水乙醇分别超声清洗5 min以去除电极表面弱吸附的氧化铝，用氮气将电极表面 吹干。经过条件优化，选择的介孔碳、酪氨酸酶以及壳寡糖的质量浓度分别为0.2、2.5 、1.5 g/L。基于介孔碳材料的电电化学酪氨酸酶生物传传感器的具体组组装步骤骤: 首先，将10 L10 g/L的酪氨酸酶溶液加人到20 L 0. 4 g/L介孔碳溶液中振荡摇匀30 min; 随后，将具有极强成膜能力的壳寡糖溶液(10 L 6 g/L)加人到上述溶液中，得到酪氨酸酶与 介孔碳的混合溶液; 最后，取4 L上述溶液滴加到洁净的玻碳电极表面，用烧杯将
14、玻碳电极盖住，使玻碳电 极表面的水分缓慢蒸干形成均一的薄膜。电极表面的水分蒸干后得到酪氨酸酶修饰的玻碳 电极。 备注：电化学测定之前，所有修饰电极均需要在50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（PH7.0)中搅 拌30 min以去除电极表面弱吸附的成分。电化学酪氨酸酶生物传感器采用恒电位方法进行苯酚检测腔制电位为-0. 1 V，基底溶液 为 8 mL50 mmol/L磷酸盐缓冲溶液)。高效液相色谱法测定条件:Diamonsil C18（Diamonsil C18是北京迪马科技有限公司色谱柱 品牌。）、色谱柱(250 mm x 4. 6 mm , 5 m)为分析柱;流动相为甲醇-水(4:1, v/v)
15、，流速 1 mL/min;检测波长为272 nm;柱温为30;进样量为10 L。电化学酪氨酸酶生物传感器检测结 果准确性（A）的评价公式:A = (CH-CE )/CH x 100%， 其中CH代表高效液相色谱法检测的浓度值;CE代表电化学酪氨酸酶生物传感器检测的浓度 值。苯酚样品的测定取5个具有代表性的水样各1 L，分别用25 、15、10 mL的苯萃取3次，合并3次萃取有机相 ，随后采用0. 45 m微孔滤膜过滤，得到待测溶液。然后分别采用电化学酪氨酸酶生物 传感器和高效液相色谱法进行苯酚检测。2.1硅球及介孔碳材料的表征通过透射电镜对 按1. 3节所述方法制备的纳米硅球进行了表征。从图1
16、a中可以看出， 这些硅球粒径均一(10 nm左右)，呈单分散性。将这些纳米硅球采用红外压片机压成片状 作为制备介孔碳的硬模板。以上述合成的硅球为模板合成的介孔碳的透射电镜图见图 1b ，可见合成的介孔碳孔径均一，排列规则有序，呈蜂窝状。结果与讨论图2给出了10 nm孔径介孔碳材料的氮气吸 附一脱附等温线及相应的孔径分布曲线。 从图2a可以看出，介孔碳材料的吸附等温 线由于毛细细管浓缩现浓缩现 象呈现较大的滞后 回路，是典型的介孔结构特征曲线，进一 步说明制备的介孔碳材料具有典型的介孔 结构。从图2b的孔径分布曲线可以看出， 10 nm孔径介孔碳的孔径分布较窄，主要 集中在812nm，其比表面积为1060 m2/g ，孔体积为3. 467cm3/g，介孔碳材料大的 比表面积和孔体积为固载和容纳酶分子提 供一个有利的微环境，与酪氨酸酶三维尺 寸(6. 5 nm x 9. 8 nm x 5. 5 nm)相近的孔径能 够发挥介孔碳材料的“空间间限制效应应”，防 止酶分子去折叠失活，保持酶
