异丙酚对发育中大鼠海马ca1区兴奋性突触反应得影响

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1、华中科技大学J 剐济医学院博【j 学位论义华中科技人学同济医学院博：L 学位论文异丙酚对发育中大鼠海马C A l 区兴奋性突触反应的影响华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科博士学位申请者孙雪华导师曾邦雄教授中文摘要异丙酚是临床常用的静脉麻醉药，因起效快，诱导舒适，恢复迅速，副作用小等优点而广泛用于临床麻醉与镇静等领域。异丙酚的麻醉作用是通过增强A型Y 一氨基丁酸( G A B A A ) 受体的功能实现的，在培养的海马神经元，大剂量的异丙酚也可直接开放G A B A A 受体氯离子通道。大量证据表明异丙酚也可作用于兴奋性谷氨酸能受体，可以呈剂量依赖性地阻断N 一甲基一D 一门冬氨酸( N

2、M D A ) 或a 氨基3 羧基一5 甲基恶唑4 丙酸( A M P A ) 受体通道。异丙酚可能是通过突触前的G A B A A 受体或离子通道抑制谷氨酸的释放从而影响兴奋性突触传递。近期研究表明海马脑片的S c h a f f e r - C A l 突触传递通路是单突触谷氨酸能神经传导通路，在不同的情况下能够被G A B A A 受体介导电流所调节或关闭，而在新生大鼠，由G A B A A 受体介导的兴奋性树突电流非常明显。海马在出生后早期发育阶段，由于2 型钾一氯共转运体( K c c 2 ) 表达和激活增强，细胞内氯离子浓度逐渐降低，从而导致G A B A 能抑制作用的增强。而麻醉

3、药异丙酚主要通过增强G A B A 。受体的功能抑制神经系统的兴奋性，在发育中的海马其作用可能有所不同，细胞内氯离子浓度可能是影响异丙酚作用的重要因素。第一部分异丙酚对发育中的大鼠海马C A l 区兴奋性突触传递的影响目的t 研究异丙酚对发育中的大鼠海马C A l 区兴奋性突触传递的影响，观察异丙酚的效应在发育过程中的变化，探讨其作用机制。24 # 中科技大学剐济医学院方法：分别将3 同龄和1 周龄雄性W i s t a r 大鼠快速断头取脑，沿冠状面切4 0 0 9 m 厚的海马脑片，镜下寻找C A t 区，电刺激靠近C A l 区的S c h a f f e r 纤维，利用膜片钳盲插技术，

4、记录全细胞兴奋性突触后电流( E P S C ) ，然后在循环液中加入不同浓度的异丙酚，观察并记录E P S C 的变化。结果：在3 周龄和1 周龄大鼠，异丙酚均呈剂量依赖性地抑制海马C A l 区兴奋性突触后电流，异丙酚的作用曲线在1 周龄大鼠较3 周龄大鼠明显右移。在3 周龄大鼠，5 0 9 M 异丙酚可明显抑制E P S C ，加药后2 5 m i n 时E P S C 值为基线的7 3 ：k 6 ，与基线相比，差异显著( p 1 6 1 。G A B A a 受体主要存在于中枢的抑制性中间神经元上，而这种中间神经元在中枢神经系统r 4 分布广泛。海马的S c h a f f e r -

5、 C A l 突触传递通路是单突触谷氨酸能神经传导通路，能够被抑制性中间神经元折返抑制。异丙酚主要是通过突触前的G A B A A 受体或离子通道抑制谷氨酸的释放而影响中枢兴奋性。但在新生大鼠，由于细胞内高氯，由G A B A A 受体介导的树突兴奋性电流非常明显。因此我们推测异丙酚的作用在海马发育过程中会有所不同。异丙酚也可作用于兴奋性谷氨酸受体，既往有研究指出异丙酚可以抑制内嗅皮层和脊髓多突触兴奋性传递，这一作用是由N M D A 受体调节的t 7 , 1 8 。活体研究表明异丙酚可以抑制大鼠海马C A l 区的兴奋性突触后电位“9 1 ，但不清楚异华中科投大学同济医学院丙酚是作用于G A

6、 B A 系统还是谷氨酸系统。因此本研究利用全细胞膜片钳技术观察不同剂量的异丙酚对发育中的海马脑片兴奋性突触后电流电位( E P S C f E P S P ) 的影n m 观察异丙酚的效应在发育过程中的变化，并应用了G A B A 受体拮抗剂以研究其作用机制，以期为异丙酚在临床应用提供理论依掘。1 材料与方法1 1 脑片制各本实验遵循中科院昆明动物研究所的规定并取得其同意。取雄性W i s t a r 大鼠( 分别为1 5 1 9 天和5 0 天，由昆明人民医院动物房提供) ，快速断头，迅速取出脑置于氧( 9 5 0 2 - - 5 C 0 2 ) 饱和的冰水人工脑脊液中，其成分为( i n

7、m M )1 2 0 N a C I ，2 5K C t ，1 2 5 N a H 2 P 0 4 2 H 2 0 ，2 6 N a H C 0 3 ，2 0 M g S 0 4 ，1 0 D g l u e o s e ，l1 9C a C 2 2H 2 0 ( 氧饱和后，p H 值为7 4 ) 。用振动切片机( V i b r o s l i c e ，U S A ) 冠状面切脑片，厚度为4 0 0 t m 1 。将脑片放在孵育槽中漫在液面下的尼龙网上，不断充以混合气，并置于3 7 C 恒温水育槽中孵育1 h ，然后置于室温中( 2 2 2 5 。c ) ，0 ，5 h 后开始实验。之所以

8、选用3 周龄大鼠，是因为这个年龄段的大鼠神经细胞膜的流动性好，细胞封接比较容易，而超过3 周龄的大鼠细胞膜流动性降低，细胞封接困难。其次，年龄超过4 周的大鼠L T D 诱导不出。1 2 膜片钳记录将脑片移入传统的记录槽中，用两片尼龙网将其固定在中间，置于直立的N i k o n 显微镜下( 1 0 x 物镜和1 0 x 目镜) ，以3 - 4 m l m i n 的速度持续灌流氧饱和的人工脑脊液，循环总容积为5 0 m l 。镜下确定海马的C A I 区( 见图1 1 ) ，将刺激电极放在靠近C A l 区的S c h a f f e r 纤维上，然后以盲插的方式缓慢将玻璃电极调整到C A

9、l 区的锥体细胞层，封接细胞，当细胞封接电阻达3 5 G Q 以上，并不再继续升高时，表示封接成功，然后给与细胞一个短暂快速的负压，使细胞膜破裂，打开细胞。将细胞膜电压钳制在7 0 m y ，等细胞电阻稳定后开始记录C A l 区锥体细胞的E P S C 。实验过程中用一个5 m v 的电压持续监测细胞的输入阻抗和串形华中刊杖人学洲济医学院电阻。串形电阻大小一般在1 0 3 0 M Q ，只有在基线记录时E P S C 的变化不超过平均值的2 0 ，记录全程中细胞的输入阻抗( 1 0 0 一3 0 0 M Q ) 相对稳定，且E P S C 的最大值不少于1 0 0 p A 时，数据才可用于分

10、析。所记录到的E P S C 是单突触的，因为在不同的刺激强度下同一缅胞的E P S C 的潜伏期稳定，通常为2 4 m s 。S c h a f f e r 侧枝c A l 是单突触的谷氨酸能神经传导通路，加上N M D A 受体在静息膜电位下处于失活状态，因此所记录到的E P S C 主要成份是由A M P A 受体介导的电流。刺激电极由两股含9 0 铂金和l O 铱的金属丝制成，外涂以太氟龙( T e f l o n ) ，两股互相缠绕，单股直径为5 0 9 i n 。记录电极用硼硅酸盐毛细玻I 离管制成( 内径0 8 4 r a m ，外径1 5 r a m ) ( W o r l d

11、P r e c i s i o nI n s t r u m e n t s ，I n c U S A ) ，当充以电极内液后其电阻为3 - 6 M f l 。电极内液成分为( i nr a M ) ：1 3 0K g l u c o n a t e ，1 0K C I ，1 0E G T A ，1C a C l 2 2 H 2 0 ，6N a C I ，1 0H E P E S ，3M g A T P ，O5N a G T P ，5Q x 3 1 4 ，用K O H 调p H 值为7 2 ，渗透压为3 2 l m O s m 。由刺激电极每隔2 0 s 给一个刺激( 频率为0 0 5 H z

12、 ) ，刺激持续时阳J 为0 1 m s ，每给一个刺激就可记录到个E P S C ，刺激强度由小到大，观察记录到的E P S C的幅值变化，当刺激强度增大而幅值不再增大时为达到E P S C 的最大值，此时选用能取得E P S C 最大值的5 0 的刺激强度为实验用刺激强度，记录1 0 m i nE P S C作为基线。兴奋性突触后电位( f E P S P ) 汜录是将刺激电极- 管放在S c h a f f e r 纤维，记录电极放在C A I 区的辐射层( s t r a t t u nr a d i a t u m ) 。电极电阻为l M Q 左右，内充以3 MN a C I 。电刺

13、激( 持续0 I m s ) 频率为O 0 3 H z ，取f E P S P 最大值的5 0 为准，记录2 0 r a i n 基线。记录f E P S P 的目的是验证全细胞记录的准确性和可靠性。我们只在3 周龄大鼠海马脑片上记录f E P S P ，这是因为1 周龄大鼠的海马脑片能记录到的f E P S P 波幅很小，只有O 1 0 2 m y ，数据分析不可信。1 3 实验分组本实验共分两大组，分别为3 周龄大鼠组和1 周龄大鼠组。在3 周龄大鼠组，3 6 张脑片共分6 小组，每组n = 6 。1 - 4 小组在循环液中分别加入不同浓度的异丙酚，称为1 0 9 M ，3 0 I I M

14、 ，5 0 9 M ，1 0 0 9 M 异丙酚小组，第5 小组为5 0 9 M 异丙酚+ 1 0 0 p Mp i c r o t o x i n 小组，此5 组记录E P S C 。第6 小组为华中科技大学J 耐济医学院5 0 9 M 异丙酚记录兴奋性突触后电位( f E P S P ) d 、组。在不同剂量的异丙酚小组，打丌细胞后，记录E P S C 基线1 0 r a i n ，然后如入不同剂量的异丙酚，再连续记录3 0 r a i n 。在5 0 9 M 异丙酚+ 1 0 0 p Mp i c r o t o x i n 小组，先向循环液中加入终浓度为l O O b t M的p i

15、c r o t o x i n ，孵育脑片0 5 h 后，再封接和打开细胞，记录E P S C 基线1 0 r a i n ，然后加入5 0 9 M 异丙酚再记录3 0 r a i n 。Rr h i ：j 3 1i s图1 , 1 海马脑片示意图( S 为刺激电极，R 为记录电极)第6 小组记录兴奋性突触后电位，先记录I E P S P 基线2 0 m i n ，再加入5 0 9 M异丙酚记录4 0 r a i n 。在l 周龄大鼠组，2 0 张脑片共分4 小组，均记录E P S C 。第l 3 小组分别为3 0 9 M ( n - 5 ) ，5 0 1 i M ( n - 6 ) ，1 0

16、 0 I t M ( n = 5 ) 异丙酚小组，第4 小组为1 0 0 9 M 异丙酚+ 1 0 0 9 Mp i c r o t o x i n 小组( n - 4 ) 。在不同剂量的异丙酚小组，打开细胞后，记录E P S C 基线1 0 m i n ，然后在循环液中加入不同剂量的异丙酚，连续记录3 0 m i n 。1 0 0 扯M 异丙酚+ 1 0 0 p M p i c r o t o x i n 小组，先向循环液中加入1 0 0 9 M p i c r o t o x i n ，孵育脑片O5 h 后，再封接和打开细胞，记录l O m i n 基线，然后加入l O M 异丙6毕中科技人学刷济医学院酚再记录3 0 r a i n 。1 4 药物异丙酚( 1 0 m m 1 ) 购买于四川蜀乐药业股份有限公司，p i c r o t o x i n ，为非特异性G A B A a 受体拮抗剂，购买于S i g m a 公司。所有药物都经循环液给予。1