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1、学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：盘茎!F 1 期：幽玎年r 月，同学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、瓠：编以供查I 蒯和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。
2、保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密团。( 请在相对应的方框内打“”)学位论文作者签名：么蜀：同期：，珍导师签名：一班同期：泸，年厂月，R幽，年r 月，日天津医科大学硕+ 学位论文中文摘要目的新生儿缺氧缺血性脑病( H I E ) 大多由围生期窒息引起，是新生儿时期的常见疾病，是引起新生儿急性死亡和神经系统损伤的重要原因之一。缺氧是发病的核心，之后出现酸中毒、缺血；引发多脏器功能损伤，心肌功能也常常受损，甚至发生心力衰竭。近年研究发现，胰岛素样生长因子1 ( I G F 1 ) 在心血管疾病发病机制中起重要作用，可以促生长、促心肌细胞肥大再生、减少细胞凋亡等，这在心肌缺血再灌注损伤
3、、严重烧伤后心肌缺血缺氧、心肌梗死、缺氧缺血性脑损伤( H I B D ) 等模型中都有研究。在H I B D 后，血液中I G F 1 的水平降低，与脑损伤及神经细胞凋亡、胃肠功能障碍等众多疾病密切相关，因此其作为疾病治疗的手段受到了人们的密切关注，但在H I B D 模型后的心肌损伤中少见报导。B c l 2 蛋白家族在细胞凋亡中起着关键性作用，B c l 2 及B a x 的含量多少决定着凋亡的进展，I G F 1 是细胞内的一个重要抗凋亡因子，它通过与细胞内许多参与细胞凋亡过程的信号蛋白相互作用，从而抑制细胞凋亡过程促进细胞生存。本实验通过制备新生大鼠H I B D 模型，腹腔注射外源
4、性重组人胰岛素样生长因子1 ( r h I G F 1 ) ，观察不同剂量I G F 对H I B D 新生大鼠心肌组织B c l 2 及B a x蛋白表达及细胞凋亡的影响，探讨I G F 心肌保护作用的分子机制，以期为临床治疗新生儿H I E 后心肌损伤提供有效的方法和途径。方法1 制备H I B D 模型：将新生7 日龄W i s t a r 大鼠行颈部正中切口，分离结扎左侧颈总动脉后给予低氧( 8 0 2 ，9 2 N 2 ) 处理2 5 小时，制成H I B D 模型。同时观察缺氧时动物行为变化，并于光镜下观察心肌组织病理改变。2 细胞凋亡及B c l 2 及B a x 蛋白表达测定：
5、4 0 只新生7 日龄W i s t a r 大鼠随机分为假手术组、H I B D 组、I G F 1 干预组，其中干预组又分为高、中、低剂量三组，每组8 只动物，于缺氧结束后立即一次性腹腔注射给药，应用免疫组织化学染色方法及细胞凋亡原位检测法( T U N E L ) ，观察给药7 2 4 时后B c l 2 及B a x 蛋白表达变化并测定心肌组织内细胞凋亡情况。结果1 H E 染色及光镜检查结果：假手术组：心肌组织结构及细胞层次清楚，细胞形态正常，无水肿。H I B D 组：心肌细胞排列紊乱，结构不清，肌横纹模糊，天津医科人学硕士学位论文部分细胞水肿，部分细胞膜破损、核溶解消失，部分细胞
6、核固缩，细胞间有较多的炎细胞浸润。2 心肌细胞凋亡情况：假手术组仅见极少量细胞凋亡，H I B D 组凋亡细胞明显增多，凋亡指数较假手术组显著增高，干预组凋亡细胞较H I B D 组减少。假手术组与I G F 1 高剂量干预组相比差异无统计学意义( 尸 o 0 5 ) ，其余各组间两两比较均有显著性差异( 尸 O 0 5 ) T h e r ei ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e ne v e r yo t h e rt w og r o u p s ( 尸 O 0 5 ) ，其余各组问比较差异有显著性( 氏O 0 5 )
7、 ；( 见表3 及图6 1 5 ，图片均见附录中)假手术组与H I B D 组B a x 、B c l 2 有显著性差异，提示二者在心肌损伤后心肌细胞凋亡中有重要意义；干预组与假手术组与H I B D 组也有显著性差异，提示了I G F 1 在减少细胞凋亡中起了重要作用；尤其是高剂量组作用更明显。表3B a x 、B c l 2 的阳性细胞数( i 4 - s ) 组别例数( 只)B a xB c l - 2ABC DE合计888884 01 3 8 士1 3 0 27 2 8 8 士8 7 旷5 1 8 8 士4 7 9 4 a I ，4 0 3 8 士2 13 4 a P t11 6 2
8、士7 2 1 0 6 聊3 5 6 2 士2 7 0 3l2 0 0 士1 8 5 213 3 8 士3 7 0 1o1 3 7 5 士2 9 1 5 03 2 8 8 士1 2 1 4 7 晰41 ，7 5 士9 3 9 2 晰2 0 7 5 士15 7 5l组比较p O 0 5 ，? 户I O O l2 6T U N E L 法检测原位心肌细胞凋亡心肌凋亡细胞的细胞核内有分布均匀的棕褐色或棕黄色颗粒，体积等于或小于正常细胞核，呈孤立，散在分布；未发生凋亡的细胞核被苏木紫染成蓝色。8天津医科大学硕士学位论文人I G F 1 对H I B D 新生大鼠心肌细胞凋亡的影响( 见图1 6 “ -
9、2 0 ，图片均见附录中)T U N E L 阳性细胞数的表达，A 组为2 3 8 + 0 5 1 8 个，B 组为5 9 3 8 + 5 9 2 7 个，C 组为4 1 2 5 4 - 8 6 8 1 个，D 组为1 9 2 5 4 - 7 8 5 1 个，E 组为6 6 2 4 - 2 3 2 6 个，除A 组于E 组比较差异无显著性( p 旧0 5 ) ，其余各组间比较差异有显著性( 尸 O 0 1 ) ，提示H I B D 后心肌细胞存在凋亡，I G F 1 干预可以减少细胞凋亡。( 见表4 )表4心肌细胞凋亡指数( 孑4 - s ) 组别例数( 只)凋亡指数ABCDE2 3 8 4
10、- 0 5 1 85 9 3 8 4 - 5 9 2 于4 1 2 5 4 - 8 6 81q B1 9 2 5 4 - 7 8 5l 晰6 6 2 士2 3 2 6 I 埘 合计402 5 7 8 4 - 2 2 5 5 9注：与A 组比较a p 0 0 1 ，与B 组比较1 3 p 0 0 1 ，与C 组比较r p 0 0 1 ，与D 组比较 恢O 0 13 讨论新生儿窒息是新生儿时期最常见的症状，发病率较高，国外报道为5 6 ，国内报道其发生率为4 7 8 9 t 3 1 ，是新生儿的重要死亡原因，还是儿童伤残的重要原因之一。围生期窒息可造成脑、心、肝、肾、肺等全身多个脏器的损害，尤以新
11、生儿H I E 为最常见，I t o o 等【4 】报道活产足月新生儿H I E 的发病率为5 5 ，L o n g 掣5 】报道，新生儿重度H I E 病死率高达5 0 ，H I E 仍然是导致新生儿死亡和神经系统后遗症的主要原因之一；其次为肾脏、心脏的损伤，分别占3 7 4 和3 3 3 ；新生儿窒息时心肌损害的发生率尸检中证实为3 7 8 t 6 J 。窒息的本质核心是缺氧，缺氧后无氧酵解增加，酸性物质堆积，细胞内酸中毒，引起机体产生典型的“潜水反射”，非生命器官血流减少，随缺氧时间延长，重要脏器血流亦减少，造成多脏器损伤。1 9 7 2 年R o w e 首先将窒息后心肌损害描述为“暂
12、时性心肌缺血( t r a n s i e n tm y o c a r d i a li s c h e m i a ) ”，文献报道，围生期窒息后心肌损伤的发生率高达2 0 - - - 5 1 ，其中9 - - 2 1 的病例发展为心力衰竭，是新生儿科常见的急危重症之一，也是导致新生儿死亡的重要原因1 7 。缺氧缺血可使一1 1 ,肌细胞能量代谢发生障碍，氧自由基生成增加，细胞内钙超载以及兴奋性氨基酸毒性作用增强等，使细胞内酶释放入血，最终导致细胞的损伤，但在A T P 耗9天津医科大学硕士学位论文人I G F 1 对H I B D 新生大鼠心肌细胞凋亡的影响竭之前，细胞已经出现损伤和死亡
13、【8 】，复苏过程会发生心肌缺血缺氧后再灌注损伤【9 】；另外细胞膜上N a + K + - A T P 酶的功能也迅速受抑制，导致心肌细胞损害；心肌细胞膜钙泵衰竭，细胞膜内外的钙离子梯度不能维持，大量钙离子内流：持续缺氧可导致肺循环压力、阻力增高，右心室后负荷增加，氧耗增加，从而加重心内膜下心肌和左室后壁的心肌缺血，病理表现为心肌细胞的凋亡、坏死，程度较轻者心肌充血，心肌细胞内空泡形成和横纹消失，重度者还可见典型的心肌梗死改变。近年来，心肌损害已引起广泛重视，姚霖等报道【l o l ，H I E 患儿心肌损害的发生与缺氧时间长短有关，缺氧时间长者心肌损害发生率高，因而早期治疗对减少心脑损伤的
14、程度有重要的临床意义。心肌损伤不止能量代谢障碍，钙内流，更多的研究关注于细胞凋亡。3 1 缺氧缺血性脑损伤动物模型的建立：窒息后多脏器损伤的发病机制还不完全清楚，尚缺乏有效地治疗措施。因此，由于伦理问题，在新生儿窒息并发症的研究中，建立合适的H I B D 动物模型十分必要。由于鼠类和人存在高度的同源性，它已成为模式研究的重要对象之一；鼠应用最为广泛，约为2 9 t 】，慢性H I B D 模型动物主要采用乳鼠制作【1 2 】。母鼠孕期短、繁殖快，有利于实验条件的控制；价格便宜、生命力强、许多针对鼠类的试剂都方便得到；伦理学上更容易接受；因此一直将新生鼠作为首选实验动物【l3 1 。生后7 d
15、 的大鼠脑与新生儿脑发育相似，并且大鼠对缺氧敏感性很高，造成脑缺氧缺血条件也与新生儿H I E 相似，且价格较低，故近年来国内外常以生后7 d 的H I B D 新生大鼠为动物模型作为研究对象。新生大鼠H I B D 模型制备的经典方法比较公认的是R i c e 的方法【l4 1 ，能较好模拟脑缺氧缺血的病理过程，已经沿用3 0 多年；但许晓霞等【“ 】研究发现其损伤程度较轻，不适宜研究重度新生儿H I E 及其并发症，故在R i c e 法的基础上进行了改良，成功建立了稳定的重度H I B D 动物模型，本实验采用了此方法，通过观察脑大体形态，可见假手术组大鼠大脑半球左右对称，未见任何病理变
16、化；H I B D组见结扎侧脑组织苍白、水肿明显，体积稍大于对侧，可看到局部出现轻重不等的液化坏死灶。H E 染色心肌病理上可看到，假手术组的心肌细胞排列较整齐，未见明显断裂及炎细胞浸润，胞浆染色均匀；H I B D 组的心肌细胞排列不整齐，肌横纹模糊，部分细胞水肿，部分细胞膜破损、核溶解消失，部分细胞核固缩，细胞问有较多的炎细胞浸润。以上结果均提示模型制作成功。3 2 缺氧缺血性脑损伤后的心肌损伤：l O天津医科大学硕士学位论文人I G F 1 对H I B D 新生大鼠心肌细胞凋亡的影响心脏功能的损害会使脑损伤进一步加重，而脑损伤后同样会加重心肌的损伤。脑损伤对心脏的影响，其机制可能如下：首先，脑损伤后下丘脑调节功能障碍，儿茶酚胺合成增多，增加了交感神经活动，可引起心肌细胞的灶性溶解坏死；引起冠
