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1、3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1 基因工程制药微生物表达系统3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.4 重组人干扰素生产工艺3.4 重组人干扰素生产工艺第三章 基因工程制药工艺第三章 基因工程制药工艺基因工程菌：基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表 达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生 物体。微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表 达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生 物体。种类：种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。细菌和酵母是重要的表达重组
2、药物的制药生物。基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1.1 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统3.1.1 酵母表达系统酵母表达系统基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类细胞：G细胞：G，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般 无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径23mm。，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般 无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径23mm。3.1.1 大肠杆菌表达系统3.1.1 大肠杆菌表达系统1、大肠杆菌（1、大肠杆菌（Eschericlia coliEschericlia coli）形
3、态特征）形态特征基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机 盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机 盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K12株的衍生菌株。基因工程中使用菌株：K12株的衍生菌株。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。2、生化与遗传特性、生化与遗传特性基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类复制起始点选择标记多克隆位点复制起始点选择
4、标记多克隆位点3、质粒载体3、质粒载体基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类?严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几 个拷贝的质粒，pSC101；严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几 个拷贝的质粒，pSC101；?松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百 个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百 个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。?克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。?测序质粒：用于基因测序。测序质粒：用于基因测序。?整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。?穿梭质粒：
5、能在两种宿主细胞存在。穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。?表达质粒：能表达基因产物表达质粒：能表达基因产物质粒类型质粒类型基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有 利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有 利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养 液中。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养 液中。4、产物表达形式、产
6、物表达形式基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70 ），培养周期短，抗污染能力强。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70 ），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素， 具有抗原性，产生热源。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素， 具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。5、优点和
7、不足5、优点和不足基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类6、应用?大量外源基因能超量的表达， 18种药物上市。大量外源基因能超量的表达， 18种药物上市。?多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）?激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)?细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）、干扰素和 ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、 白介素-1拮抗剂细胞因子类：5种干扰素（1种PEG化）、干扰素和 ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-1
8、1、 白介素-1拮抗剂?溶栓酶类：rPA溶栓酶类：rPA?白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。3.1.2 酵母表达系统酵母表达系统1、形态特征、形态特征基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细
9、胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细 胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因2、生长与遗传特征、生长与遗传特征基因工程制药工程菌种类
10、基因工程制药工程菌种类五种类型的载体，五种类型的载体，安全、无毒。安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和 加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和 加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。3、优点与不足、优点与不足基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类1981
11、年Hitzman等：酵母表达人干扰素1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素?激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶 和水蛭素，激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶 和水蛭素，细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子?多肽类：高血糖素多肽类：高血糖素?2种乙肝疫苗等。2种乙肝疫苗等。?8种产品8种产品4、应用、应用基因工程制药工程菌种类基因工程制药工程菌种类小结?表达系统：宿主菌+表达质粒表达系统：宿主菌+表达质粒?生物学，生产特征生物学，生产特征?大肠杆菌系统：大肠杆菌系统：?酵母系统：酵母系统：基因工程制药基因工程制药工程菌与构
12、建工程菌与构建思考题（1）分析比较基因工程大肠杆菌和酵母表达系 统制药的优缺点，如何选择应用？（1）分析比较基因工程大肠杆菌和酵母表达系 统制药的优缺点，如何选择应用？（2）这两个系统生产了哪些重组蛋白质药物？（2）这两个系统生产了哪些重组蛋白质药物？基因工程制药基因工程制药3.1 基因工程制药微生物表达系统3.1 基因工程制药微生物表达系统3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.3 基因工程菌的发酵培养与控制3.4 重组人干扰素生产工艺3.4 重组人干扰素生产工艺第三章 基因工程制药工艺第三章 基因工程制药工艺3.2.1 构建
13、流程构建流程3.2.2 表达载体构建表达载体构建3.2.3 工程菌构建工程菌构建3.2 基因工程大肠杆菌的构建技术基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建3.2.1 工程菌构建流程目标基因克隆目标基因克隆表达载体构建表达载体构建工程菌工程菌外源基因导入与培养外源基因导入与培养遗传转化与筛选遗传转化与筛选PCR，文库，化学合成PCR，文库，化学合成酶切，连接酶切，连接基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?表达载体设计表达载体设计?目标基因的定位克隆目标基因的定位克隆?酶切反应酶切反应?连接反应连接反应?转化转化?筛选与鉴定筛选与鉴定3.2.2 表达载体构建3.2.2 表达载体构建基因
14、工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?表达载体概念：表达载体概念：expression vector expression vector 在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入 外源基因表达盒所构成。在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入 外源基因表达盒所构成。?外源基因表达盒(操纵子模型)：外源基因表达盒(操纵子模型)：1、表达载体的设计1、表达载体的设计目 标 基 因目 标 基 因终止子终止子启 动子启 动子基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?PCR (Polymerase chain reaction, PCR)：PCR (Polymerase chain reaction
15、, PCR)：聚合酶链式反应：由DNA聚合酶催化下，对特定的 DNA 序列进行的复制反应。聚合酶链式反应：由DNA聚合酶催化下，对特定的 DNA 序列进行的复制反应。?本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。?发明者：Mullis，生物技术革命性象征。发明者：Mullis，生物技术革命性象征。2、 目标基因PCR定位克隆2、 目标基因PCR定位克隆（1）PCR技术（1）PCR技术基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建(2)退火退火 (55)(4)完成一个循环完成一个循环(3)延伸延伸 (72)(1)变性变性 (94)（2）PCR单反应原理与
16、过程（2）PCR单反应原理与过程基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建（3）PCR循环（3）PCR循环基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建?模板 DNA：目标序列,10010 000bp,pg模板 DNA：目标序列,10010 000bp,pg?引物：两条寡核苷酸，引物：两条寡核苷酸，2127 bp。2127 bp。?脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTP脱氧核苷酸：4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTP?DNA聚合酶: Taq聚合酶，耐高温DNA聚合酶: Taq聚合酶，耐高温?缓冲溶液：50 mM KCl、10 mM TrisHCl,1.5 mM MgCl缓冲溶液：50 mM KCl、10 mM TrisHCl,1.5 mM MgCl2 2 （4） PCR扩增的反应体系组成（4） PCR扩增的反应体系组成基因工程制药工程菌构建基因工程制药工程菌构建（5）PCR扩增产物（5）PCR扩增产物?程序：温度，时间，循环数程序：温度，时间，循环数?电泳：目标基因片段大小
