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1、 免疫学实习指导 免疫学实习指导 高晓明高晓明 主编主编 免疫学系免疫学系 集体编写集体编写 北京大学医学部基础医学院免疫学系北京大学医学部基础医学院免疫学系 2004 年年 12 月月 序 言 序 言 本实习指导内容的安排与免疫学理论课的内容相衔接，主要包括免疫学的经典实验，即吞噬细胞吞噬功能检测、补体结合试验、T 淋巴细胞转化试验、 免疫标记技术 （膜表面免疫球蛋白的检测、 ELISA） 、溶血空斑试验、沉淀反应。细胞凋亡的检测为新增加的实验。 本指导旨在让学生在有限的时间内学到现代免疫学常用的实验方法和技术， 并使学生通过实验课的学习进一步认识和巩固课堂所学的知识，同时培养学生的实际操作
2、能力及分析问题、解决问题的科学思维能力。 本指导适用于我校 8 年制、6 年制、5 年制的基础、医疗、预防、口腔医学及护理、药学专业。不妥之处望指导教师和学生在使用过程中坦诚指出，以利进一步改进。 1实验室规则实验室规则 一、 进入实习室实验要穿白大衣。 二、 除实验中必用的学习用品外， 其他物品不要放在实验台上。 书包放桌屉内，衣帽挂衣架上。 三、 实习室内不允许吃食物或饮料，严禁吸烟。 四、 实验中一定要保持实习室安静，彼此讨论问题时不要大声喧哗、严禁打闹。 五、 实验过程要按照教师要求进行操作，如有疑问要请教指导教师。 六、 爱护实验器材， 如有损坏应及时报告教师， 需赔偿者按规定办理。
3、 七、 实验完毕，要清理台面。需冲洗的物品按要求冲洗，需收回的物品按要求摆放整齐送回教学准备室。 八、 值日生要做好值日， 离开实习室时， 一定要有专人负责关好门窗、水源及照明设备。 2免疫学实验课授课进度免疫学实验课授课进度 本授课进度供承担免疫学实验教学（8 年制）任务的教师使用和参考，为保证实验课内 容充实，有些实验课的内容安排可能超过规定的学时数，希望任课教师能合理安排时间，必 要时，可将几个实验内容穿插进行，以保证教学进度。 1、 单扩、双扩及免疫电泳（示教）共 2 学时 （1） 原理、试验方法及注意事项的讲解（15 分钟） （2） 双扩铺板和打孔（30 分钟） （3） 单扩打孔和单
4、、双扩加样（30 分钟） （4） 电泳示教及原理讲解（15 分钟） （5） 小结 10 分钟 2、 溶血空斑试验小室液相法（PFC）和分析单扩和双扩结果 共 2 学时 （1） 原理、试验方法及注意事项的讲解（15 分钟） （2） 取小鼠脾脏和制备单细胞悬液（30 分钟） （3） 离心、灌注小室和封腊（30 分钟） （4） 观察和分析单、双扩结果（20 分钟） （5） 观察 PFC 结果和小结 10 分钟 3、 吞噬细胞吞噬试验和免疫荧光染色实验 共 3 学时 （1） 原理、试验方法及注意事项的讲解（15 分钟） （2） 吞噬细胞吞噬实验 （共 65 分钟） A 小鼠注射 SRBC （20 分钟
5、） B 小鼠腹腔取巨噬细胞和涂片（30 分钟） C 观察结果（15 分钟） （3） 免疫荧光染色实验（共 120 分钟） A 取小鼠脾脏和制备单细胞悬液及稀释计数 （30 分钟） B 荧光染色（40 分钟） C 离心备涂片（20 分钟） D 荧光显微镜观察（30 分钟） （4） 小结 10 分钟 4、 淋巴细胞转化试验和 ELISA 检测 IgE 试验（一）共 2 学时 （1） 原理、试验方法及注意事项的讲解（15 分钟） （2） 取小鼠脾脏和制备单细胞悬液（30 分钟） （3） 加样（30 分钟） （4） ELISA 包板（20 分钟） （5） 小结 10 分钟 5、 ELISA 检测 Ig
6、E 试验（二）和观察分析淋巴细胞转化试验结果 共 3 学时 3（1） 原理、试验方法及注意事项的讲解（15 分钟） （2） 洗板和加抗原（20 分钟） （3） 37OC孵育（40 分钟） （4） 洗板、加酶标抗体（20 分钟） （5） 37OC孵育（40 分钟） （6） 洗板、加底物（20 分钟） （7） 显色（20 分钟） （8） 加终止液和观察结果（10 分钟） （9） 观察淋巴细胞转化结果（15 分钟） （10） 取小鼠胸腺，制备胸腺细胞悬液（15 分钟） （11） 离心（20 分钟） （12） Annexin V-FITC 抗体染色（30 分钟） （13） 荧光显微镜观察结果（30 分
7、钟） （14） 小结 10 分钟 6、 细胞毒试验及 E 花环形成（示教）和免疫器官（示教）2 学时 （1） 原理、试验方法及注意事项的讲解（15 分钟） （2） 细胞毒试验加样（30 分钟） （3） 37OC孵育（30 分钟） （4） 示教 E 花环（15 分钟） （5） 示教免疫器官胸腺及脾脏（15 分钟） （6） 小结 10 分钟 4目 录 实验一、免疫器官（示教） （1） 实验二、单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（示教） （4） 实验三、吞噬细胞功能检测 （10） 实验四、B 淋巴细胞膜表面免疫球蛋白（SmIgG）的检测直接免疫荧光法 （12） 实验五、溶血空斑形成（液相小室法）试验（
8、PFC）体外抗体形成细胞检测 （14） 实验六、T 淋巴细胞转化试验（MTT 法） （16） 实验七、酶联免疫吸附试验（ELISA） （18） 实验八、细胞凋亡检测 （21） 实验九、补体介导的细胞毒试验 （26） 实验十、E 玫瑰花环形成试验（示教） （28） 5实验一、免疫器官 实验一、免疫器官 (Organs of the Immune System)(Organs of the Immune System) （本实验属于示教内容） （本实验属于示教内容） 免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官。在哺乳类动物，中枢免疫器官 包括胸腺和骨髓；在禽类，中枢免疫器官包括胸腺和法氏囊。外周免疫器
9、官有淋 巴结、脾脏等。 胸腺（Thymus） 胸腺位于胸腔纵隔上部， 胸骨后方。 胸腺在胚胎期及出生后 2 岁内生长很快， 体积较大；2 岁后到青春期发育仍很快；但青春期后开始萎缩，逐渐由脂肪组织 所代替，它在机体免疫功能的建立上占有重要地位。骨髓内有部分淋巴细胞迁移 到胸腺内，在胸腺素的影响下，增殖分化成为具有免疫功能的 T 细胞，再经血流 输送到淋巴结和脾等周围免疫器官发挥免疫功能。 若新生期切除胸腺或胸腺生长 肿瘤，可导致细胞免疫功能显著下降，常因感染而死亡。 胸腺的组织结构：胸腺分左右两叶，表面覆盖有一层结缔组织被膜，被膜深 入实质将实质分割成若干小叶。胸腺小叶的外层为皮质，内层为髓质
10、。胸腺皮质 区分为浅皮质区和深皮质区。皮质区内 85%-90%的细胞为未成熟的 T 细胞。髓质 区内有大量的胸腺上皮细胞和稀疏分散的较成熟的胸腺细胞、单核-巨噬细胞和 DC. 标本：胎儿胸腺、胸腺组织切片 图 1.胸腺 不同年龄期的胸腺示意图 1骨髓(Bone marrow) 骨髓(Bone marrow) 骨髓位于骨髓腔中，分为红骨髓和黄骨髓。红骨髓有造血功能，由造血组织 和血窦构成。 造血组织主要由基质细胞和造血细胞组成。 基质细胞包括网状细胞、 成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等。骨髓是各类血细胞和免疫细胞发生的 场所。骨髓又是 B 细胞分化成熟的场所和体液免疫应答发生的场所。因此骨髓
11、既 是中枢免疫器官又是外周免疫器官。 标本：骨髓组织切片 法氏囊（Bursa of Fabricius） 在禽类，法氏囊是位于泄殖腔上方的一个囊状物，内充满着淋巴组织，其中 淋巴细胞不断受囊素的影响，发育成 B 淋巴细胞。若新生期切除法氏囊，抗体的 形成将受影响，而细胞免疫功能不受影响。对于 B 淋巴细胞发育而言，禽类的法 氏囊具有哺乳类动物骨髓相似的作用。 标本：鸡法氏囊 淋巴结（Lymphoid node） 淋巴结（Lymphoid node） 淋巴结的实质分为皮质区和髓质区两部分。 皮质区分为浅皮质区和深皮质区 两部分。浅皮质区靠近被膜下，是 B 细胞定居的场所，称为非胸腺依赖区 （th
12、ymus-independent area） 。该区内大量 B 细胞聚集形成淋巴滤泡，或称淋巴 小结。浅皮质区与髓质之间的深皮质区是副皮质区，是 T 细胞定居的场所，称为 胸腺依赖区（thymus-dependent area） 。髓质区有髓索和髓窦组成，髓索由致密 聚集的淋巴细胞组成，主要为 B 细胞和浆细胞。 标本：人淋巴结切片 图 2.淋巴结 2脾（Spleen） 脾（Spleen） 脾实质可分为白髓和红髓。白髓为密集的淋巴组织，为 T 细胞区。白髓与红 髓交界的狭窄区域为边缘区，内含 T 细胞、B 细胞和较多 M。红髓有髓索和髓 窦组成。髓索为索条状组织，主要含 B 细胞、浆细胞、M
13、和 DC. 标本：人脾组织切片 图 3.脾脏 3实验二、单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（示教）实验二、单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（示教） （Single Immunodiffusion and Double Immunodiffusion） 可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解 质存在的条件下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以 是多糖、蛋白质、脂类等。 根据抗原与抗体的不同条件及其它因素， 沉淀反应可以分为以下三种主要形 式。即：环状沉淀反应(ring precipitation reaction)，凝胶中沉淀反应(precipitat
14、ion reaction in gel)，如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验 中的絮状沉淀反应(flocculation precipitation reaction)，如梅毒血清检验中的康氏 （Kahn） 及克莱氏 （Kline） 试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek 氏试验， 检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。 （一） 单向免疫扩散单向免疫扩散(Single immunodiffusion)人群血清人群血清 IgG 正常值 测定正常值 测定 一、基本原理一、基本原理 在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗
15、原向周围 扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正 相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标 本的抗原浓度(mg/ml 或 U/ml)。 应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中 IgG、IgA 及 IgM 的水平。 二、实验材料二、实验材料 2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含 2%NaN3） 。 标准马抗人 IgG 血清（抗体） （北京生物制品研究所生产） 工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产） pH7.2 PBS. 打孔器（孔径 3mm）及打孔模板 微量加样器 湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料） 已制备好的含有 1%马抗人 IgG 抗体的琼脂板 1/50 稀释的单人份待检血清标本 三、实验方法三、实验方法 4（一）标准曲线的制备：示教 1按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的 1%离子琼脂。首先分装其 1/2 量的 2%盐水琼脂，例如，用普通载玻片制做时需 1%离子琼脂 4ml，在分装 2%盐水琼脂时即为
