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1、中国医科大学硕士学位论文非选择性钾离子通道阻断剂对多西紫杉醇抗人乳腺癌细胞MDA- MB-435S作用的影响姓名：宋依凝申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：金万宝20080101英文缩略语8中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签
2、名：垒遨日期：型：墨! !中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文论文作者签名：指导教师签名：日中文论著摘要-非选择性钾离子通道阻断剂对多西紫杉醇抗人乳腺癌细胞M D A - M B - 4 3
3、5 S 作用的影响刖声乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈不断上升趋势。钾通道电流( I K ) 在肿瘤细胞中的生物物理特性及其在肿瘤细胞生长中的调控作用已经被广泛研究。研究发现，k 在肿瘤细胞增殖中具有促进作用，促进I K 传导的各种因子如缬氨霉素、泌乳素、胎牛血清等可刺激肿瘤细胞增殖；k 阻断剂如四乙胺 ( 删、4 氨基毗啶( 4 - A P ) 等既能抑制各种肿瘤细胞中的k ，又能抑制这些细胞的增殖。钾离子通道作为肿瘤细胞增殖关键调控物观点，近来已经被许多实验及临床证据所认同。钾离子通道活性的增加与增殖速率的提高有关，但是，钾离子通道调控肿瘤细胞增殖的机制尚不甚明了。抗肿瘤药多西
4、紫杉醇( d o c e t a x e l ，D O C ) 是由植物T a x u sb a c c a m 针叶中提取巴卡丁( b a c c a t i n ) 经半合成改造而成，其基本结构类似紫杉醇，但水溶性较高。其为细胞有丝分裂抑制剂，通过促进小管聚合成稳定的微管抑制其解聚，使游离小管的数量明显减少而影响细胞的有丝分裂，导致细胞周期的变化，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用。目的l 、D O C 、非选择性钾离子通道阻断剂4 - A P 及D O C 与4 - A P 联合应用对人乳腺癌细胞M D A - M B 4 3 5 S 细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响。2 、明确非选择性钾
5、离子通道阻断剂4 - A P 对D O C 抗人乳腺癌细胞M D A M B - 4 3 5 S 作用的影响机制，为开发一种多靶点治疗乳腺癌方案提供理论依据。方法1 、M T T 比色法检测药物对M D A - M B 4 3 5 S 细胞增殖的影响：取对数生长期细胞接种孵育，药物处理2 4 、4 8 、7 2 h 后，每孔加5 嵋曲d 的M T T l 0 山，3 7 继续培养4 h 后弃液，每孔加D M S O1 0 0 m ，6 0r p m 振荡1 0 m i l l ，E L x 8 0 0通用型酶标仪于5 7 0n m 处测O D 值，并计算增殖抑制率。抑制率计算如下：抑制率( )
6、 = ( 对照孔O D 均值一实验孔O D 均值) 对照孔O D 均值x 1 0 0 。2 、流式细胞术A n n e x i nV - F I T C P I 双染法检测药物对M D A - M B 一4 3 5 S 细胞凋亡的影响：取对数生长期细胞接种，药物处理2 4h 后收集细胞，1 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃上清，加入1 0 3m 冰冷的P B S 使细胞悬浮，重复以上步骤两次，然后将细胞重悬于2 0 0 山B i n d i n gB u f f e r 中，加入1 0I _ t lA n n e x i nV - F I T C 和5mP I 混匀，室温避光反
7、应1 5r a i n ，加入3 0 0mB i n d i n gB u f f e r 混匀，1h 内流式细胞仪检测细胞凋亡。3 、流式细胞术P I 单染法检测药物对M D A - M B 4 3 5 S 细胞周期的影响：取对数生长期细胞接种，药物处理2 4h 后收集细胞，1 0 0 0r p m 离心5r a i n ，弃上清，加入1 0 3 m 冰冷的P B S 使细胞悬浮，重复以上步骤3 次后缓缓加入1 0 3 山冰冷的7 5 乙醇，4 过夜，次日，1 5 0 0r p m 离心1 0 r a i n ，小心弃上清后加入1 0 3u 1 冰冷的P B S 使细胞悬浮，1 5 0 0r
8、 p m 离心5m i n 后小心弃上清，加入O 1I t g 皿一1P I 和O 1 嵋肛1R t l f l B eA 各5 0 0m ，3 7 培养4 0r a i n 后流式细胞仪检测细胞周期。实验结果1 、D O C 、4 - A P 单独应用均能抑制M D A - M B 4 3 5 S 的增殖；5 x 1 0 3I m a o l L 1的4 A P 合用2 5t m a o l L 1 的D O C 对M D A M B - 4 3 5 S 达最大抑制率的时间明显缩短，由7 2h 缩短到2 4h ；D O C 和4 A P 对M D A M B - 4 3 5 S 的增殖抑制有
9、相加作用，并呈剂量时间依赖性( P 1 1 5 为协同( 抖) 实验结果1 、4 - A P 对D O C 抑制M D A - M B 一4 3 5 S 细胞增殖的影响如图lA 所示，D O C 单独应用能明显抑制M D A - M B - 4 3 5 S 的增殖，呈剂量时间依赖性( P ( o 0 5 ) ，2 5g , m o l - L - 1D O C 单用7 2h 已近最大抑制率1 0 0 ，抑制率为9 9 9 ；如图lB 所示，D O C 和4 - A P 联合应用，对M D A - M B 4 3 5 S增殖抑制作用也呈现剂量时间依赖性( P 0 0 5 ) ，2 5I m a
10、o l L 4D O C 发挥最大增殖抑制作用的时间由7 2 h 缩短到2 4 h ；同时4 - A P 与不同浓度的D O C 联用组对M D A - M B 4 3 5 S 的抑制率明显高于同一作用时间不同浓度的D O C 单独应用组( 见表1 ) 。以金正均Q 值法判断两种药物合用抑制率的结果如表1 所示，D O C 和4 - A P 联合应用4 8 、7 2h 时对M D A M B 4 3 5 S 的增殖抑制产生相加作用。2 、D O C 单独应用以及与4 - A P 联合应用对M D A M B 一4 3 5 S 细胞凋亡的影响如图2C 、D 及表2 所示，D O C 单独作用于M
11、 D A M B - 4 3 5 S 时能明显增加细胞的晚期凋亡和死亡( u 时，并且呈剂量依赖性( P o 0 5 ) ，但对细胞的早期凋亡( L 勘影响并不明显。如图2B 及表2 所示，单独应用的4 - A P 作用于M D A - M B - 4 3 5 S 能诱导较少的早期凋亡，与对照组相比无明显差异。如图2E 、F 及表2 所示，两药联合作用于M D A - M B - 4 3 5 S 能明显增加细胞的早期凋亡、晚期凋亡及死亡，同时随着D O C 剂量的增加，晚期凋亡细胞与死亡细胞明显增加，与对照组相比，早期凋亡细胞( L R ) 由2 0 8 士O 3 3 增加到2I m a o
12、l - L 1D O C + 5 1 CI m a o l - L 14 - A P 组的2 0 4 1 士2 8 7 和5t t m o l - L 。1D O C + 5 , , 1 0 3 p a n o l L 1 4 A P 组的1 5 6 0 士1 1 2 ，晚期凋亡和死亡细胞( U 鼬由6 9 9 4 - 1 1 5 增加到2I t m o l - L 。1D O C + 5 , , 1 0 3p , m o l L - 14 - A P 组的2 0 6 7 4 -0 9 1 和5l u n o l - L - 1D O C + 5 1 0 3l u n o l L 14 - A
13、 P 组的1 1 9 8 士0 9 3 ( P ( o 0 5 ) 但早期凋亡的变化却未呈剂量依赖性。3 、D O C 单独应用以及与4 A P 联合应用对M D A - M B 一4 3 5 S 细胞周期的影响如图3C 、D 及表3 所示，D O C 单独作用于M D A - M B - 4 3 5 S 能明显使细胞阻断在G d M 期，细胞比率由对照组的7 4 l 士2 8 9 增加到2l a m o l L 1D O C 组的3 0 7 3 4 - 1 6 9 和5l u n o l L 。1D O C 组的7 6 2 6 4 - O 8 4 ( P o 0 5 ) 。同时使G d G
14、l 期细胞减少，由对照组的7 0 7 9 4 - 0 6 2 减少到2l J m o l L 1 D O C 组的4 4 4 3 4 - 2 7 3 和5l u n o l L 1 D O C 组的4 0 5 4 - 0 9 3 ( P 0 0 1 ) ，并且呈剂量依赖性p 0 0 5 ) 。如图3B 所示，5 1 0 3 a - a o l L 14 - A P 单独作用于M D A - M B - 4 3 5 S 能使细胞阻断在G 0 ，G l 期，由7 0 7 9 4 - O 6 2 增加到7 5 7 3 4 - O 4 0 ，G A V i 期细胞明显减少甚至消失，由7 4 1 士2
15、8 9 减少到4 5 1 4 - O 8 5 ( P ，o 0 5 ) 。如图3E 、F 及表3 所示，两药联合作用于M D A - M B - 4 3 5 S 能使G o G l 期细胞减少，G 办I 期细胞增加，同时S 期细胞也有所增加，这种变化随D O C 药物剂量的增加而愈加明显护 o 0 5 ) 。01 02 03 04 05 06 00l O2 03 04 05 06 0C o n c e n t r a t i o nD O C ( 阻 n o l - L 1 1 + 5 x 1 0 3p m o l - L - 14 - A P图l ，药物对M D A M B - - 4 3
16、5 S 细胞增殖的影响 A ；不同浓度D O C 对M D A - M B - 4 3 5 S 的增殖抑制率( 哟 B ：不同浓度D O C 与5 x 1 0 3p m o l L - 14 - A P 联合应用对M D A - M B - 4 3 5 S 的增殖抑制率( )1 4鲫砷柏柏O一。Co霉蔷ao量五jI砷舯砷如加0Se口罩日蕾目。召写1q旦表l ，D O C 单独应用及与5 x 1 0 3o a m o l L 14 - A P 联合应用对M D A - M B - 4 3 5 8 细胞增殖的影响( g + s ，n = 3 )2D O c 浓度蔷( u n 0 1 L 。)细胞增殖抑制率( )D O C 单独应用( E 1 )
