《自然调节性t细胞通过修饰前炎症应答介导脑型疟疾的发生》由会员分享，可在线阅读，更多相关《自然调节性t细胞通过修饰前炎症应答介导脑型疟疾的发生（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、目录l I I II I1I I I IlitI Ii llIII 17 6 9 2 9 8一、摘要中文论著摘要l英文论著摘要6二、英文缩略语1 2三、论文前言1 3刚舌“1 3材料与方法1 4实验结果1 7讨论”2 7结论“2 9四、本研究创新性的自我评价3 0五、参考文献3 l六、附录综述”3 4在学期问科研成绩5 0致谢5 2个人简介5 3中文论著摘要自然调节性T 细胞通过修饰前炎症应答介导脑型疟疾的发生实验目的疟疾感染是当今威胁人类健康的主要难题之一，每年有一百多万儿童死于疟疾。脑型疟疾( c e r e b r a lm a l a r i a , C M ) ，简称脑疟，是疟疾最严
2、重的并发症之一，而且是疟疾感染的主要死因。C M 严重性的决定因素尚不完全清楚，但很可能来自宿主和寄生虫两方面。最终，寄生虫和免疫应答的相互作用决定宿主感染结局。因此，关于C M 发生免疫机制的基础研究是研制有效抗疟疫苗和药物的前提。伯氏疟原虫( P l a s m o d i u mb e r g h e iA N K A ，P b A N K A ) 鼠疟与人类疾病有许多共同特征，是现有C M 的最佳模型。目前研究认为C M 是由脑血管内感染红细胞( p a r a s i t i z e dr e db l o o dc e l l s ，p R B C ) 粘附和细胞因子及效应细胞介导
3、的强烈的宿主前炎症应答的结合效应引起的疾病。相关研究表明活化T 细胞介导的免疫应答参与疾病诱导，并且C D 4 + T 细胞和C D 8 + T 细胞均可促进脑病变发生。事实上，1 1 1 l 应答在控制虫血症方面发挥关键作用，同时也促进C M 发生。C D 4 + C D 2 5 + 调节性T 细胞( r e g u l a t o r yTc e l l s ，T r e g s ) 是不同于T 1 1 1 和T h 2 的具有免疫调节效应的T 细胞亚群。T r e g s 活化是寄生虫逃避宿主免疫的机制之一。前期试验己证明T r e g s 活化与约氏疟原虫( P l a s m o 以
4、u m y o e l i i1 7 X L ，P y o e l i i1 7 X L )感染鼠的易感性相关，T r e g s 可通过修饰树突状细胞( D e n d r i t i cc e l l s ，D C s ) 应答，诱导I L 1 0 产生和C D 4 + T 细胞凋亡调控T h l 应答。为此本研究动态观察了正常感染鼠及T r e g s 消除鼠前炎性细胞因子，抗炎性细胞因子表达水平和T r e g s 增殖变化，以期阐明T r e g s 在脑疟发生中的作用地位及其相关机制。实验方法1 、实验动物模型构建及C M 病变评估6 8 w ，雌性C 5 7 B L 6 经腹腔感
5、染l x l 0 6 P b e r g h e i A N K A 寄生的红细胞( p R B C )构建C M 易感模型，感染B A L B c 和D B A 2 鼠构建C M 抵抗模型。实验组f 6 只组) 和对照组( 6 只组) 小鼠于感染前l d 和感染后l d 分别经腹腔注射l m ga n t i - C D 2 5 m A b ( 7 D 4 ，r a tI g M ；B i oE x p r e s s ) 和等体积p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ( P B S )构建T r e g s 消除小鼠模型。感染后6 天起每
6、日监测鼠两次，评价临床实验脑疟( E x p e r i m e n t a lc e r e b r a lm a l a r i a , E C M ) 症状，用以下症状确定E C M 得分：皮毛竖起、颤抖、肢体瘫痪、痉挛、昏迷。每出现一个症状给予1 分，累计得分 4 分者考虑为重型疟疾。2 、流式细胞术检测脾细胞悬液中C D 4 + T 细胞群内C D 4 + C D 2 5 + F o x p 3 + T r e g s 的百分含量分别于感染前和感染后第3 d 、5 d 、8 d 常规无菌取出小鼠脾脏，用0 1 7 m o l LN H 4 C 1 裂解红细胞，以含1 0 胎牛血清(
7、F e t a lc a l f s e r u m ，F C S ) 的R P M l l 6 4 0 调整脾细胞终浓度为lx l O7 m l 。每份样品用F I T C - c o n j u g a t e da n t i m o u s eC D 4 L 3 T 4 ( G K l 5 ；B DP h a r m i n g e n ) ，A P C c o n j u g a t e da n t i - m o u s eC D 2 5 I L - 2r e c e p t o ra l p h a ( P C 61 ；B DP h a r m i n g e n ) 和P E
8、 c o n j u g a t e da n t i - F o x p 3 ( c l o n eF J K l6 s ；e B i o s c i e n c e ) 进行三色分析，另设阴性对照管。在流式细胞仪专用染色管中加入新鲜制备的1 x 1 0 7 m l 脾细胞悬液0 1 m l ，并用F c Y I I I I I 封闭抗体孵育以阻断荧光抗体的非特异染色，再加入抗C D 4 F I T C 和抗C D 2 5 A P Cm A b 进行表面染色，固定透膜后，用抗F o x p 3 P Em A b进行胞浆内染色，用含1 F C S 的P B S 洗涤两次并悬浮于5 0 0 p
9、l P B S q b ，流式细胞仪( B e c t o nD i c k i n s o n ，U S A ) 进行检测。以前向和侧向散射角确定淋巴细胞群，C D 4 + T细胞画门，分析计算C D 4 + T 细胞群C D 4 + C D 2 5 + F o x p 3 + T r e g s l 拘百分率。3 、采用双抗体夹一t , E L I S A 法检测脾细胞培养上清I F N 吖、T N F 仅、I L 6 、I L 1 7 、I L 1 0 及G r i e s s 方法检测N 0 2 - 含量2( 1 ) 脾细胞样品制备分别于感染前和感染后第3 d ，5 d ，8 d 常规
10、无菌取出小鼠脾脏，用0 1 7 m o l LN H 4 C 1 裂解红细胞。以含1 0 F C S 的R P M l l 6 4 0 调整脾细胞终浓度为1x 1 0 7 m l ，于2 4 孔培养板中，每孔加入5 0 0 p l 脾细胞悬液于3 7 。C ，5 C 0 2条件下培养4 8 h 。需要注意的是天然脾细胞与纯化N A L Eh a m s t e ra n t i m o u s eC D 3 e( 1 4 5 2 C 1l ，B DP h a r m i n g e n ，O 5 6 t l w e l l ) 和纯化N A L Eh a m s t e ra n t i m
11、o u s eC D 2 8( 3 7 5 1 ，B DP h a r m i n g e n ，0 11 2J - t l w e l l ) 于3 7 * C ，5 c 0 2 条件下共同培养4 8 h 以刺激I L 1 7 产生，随后收集培养上清，8 0 。C 保存，待细胞因子及N O 检测。( 2 ) 双抗体夹- t , E L I S A 试剂盒分别检测脾细胞培养上清I F N - y 、T N F a 、I L 6 、I L 1 0 、I L - 1 7 的分泌水平，酶标仪测定4 5 0 n m 处O D 值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用S o f t M a xP
12、r o4 3 1 L s 软件分析，计算细胞因子含量( p g m 1 ) 。( 3 ) G r i e s s 方法检测脾细胞培养上清中N 0 2 。含量l o o p I 上清和G r i e s s 反应液1 0 0 p 1 室温反应1 0 m i n ，用N a N 0 2 作为标准品，酶标仪检测5 5 0 n m 处O D 值。实验结果l 、感染率、幸存率与疾病评估脑疟是通过给C 5 7 B L 6 小鼠注射毒性P b A N K A 血液阶段寄生虫诱导的，C 5 7 B L 6 小鼠于感染后8 1 1 天死于麻痹和昏迷，虫血症为1 0 2 0 。相比而言，抵抗型B A L B c
13、和D B A 2 小鼠经历类似的寄生虫生长但不发生脑病变，于感染后3 - 4 W 死于贫血和过度虫血症( 6 0 ) 。从脑疟症状的临床得分来看，C 5 7 B L 6 小鼠得分高于B A L B c 和D B A 2 小鼠。2 、易感和抵抗小鼠感染期间脾细胞培养上清前炎性细胞因子、抗炎性细胞因子和N O 水平的动态检测C M 易感C 5 7 B L 6 鼠和抵抗B A L B c 与D B A 2 鼠脾细胞培养上清前炎性细胞因子I F N - 7 、T N F 0 【、I L 6 、I L 1 7 及N O 于感染后开始升高，感染后5 天达峰值，感染后8 天下降( C 5 7 B L 6 鼠
14、呈现轻微下降) 。三种鼠脾细胞培养上清抗炎性细胞因子I L 1 0 也于感染后5 天达峰值，在感染后8 天C 5 7 B L 6 鼠I L 1 0 水平显著下降，抵抗B A L B c 与D B A 2 鼠I L 1 0 水平轻微下降。易感鼠脾细胞培养上清前炎性细胞因子和N O 水平显著高于抵抗鼠，而I L 1 0 水平显著低于抵抗鼠。3 、易感和抵抗小鼠感染后不同时间点脾C D 4 + T 细胞中T r e g s 的百分比和绝对数C M 易感鼠和抵抗鼠脾脏C D 4 + T 细胞中T r e g s 百分比和绝对数于感染后开始升高，感染后3 天达峰值，感染后5 天到8 天逐渐下降。并且在感染期间，C 5 7 B L 6鼠脾脏C D 4 + T 细胞中T r e g s 百分比和绝对数显著低于B A L B c 和D B A 2 小鼠。4 、体内C D 2 5 消除后T r e g s 效应分析C D 2 5 消除的C 5 7 B L 6 、B A L B c 和D B A 2 小鼠脾脏C D 4 + T 细胞中T r e g s 百分数显著低于相应对照鼠。与正常感染鼠相比，T r e g s 消除的C 5 7 B L 6 鼠幸存率
