细菌内毒素和热原检查法

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1、细菌内毒素和 热原检查法l 郝树彬基础知识热原：注入人体后可 引起发热反应的物质。1 材料的致热性。2 因微生物污染造成的热原反应。热原的检查方法l体内热原检查法兔温法（PT)l是一种体内的、全热原的检查方法。 1942年USP12版第一次收载。各国药典至今仍在 使用。l体外热原检查法（ITP)l是一种体外的利用人血细胞反应的全 热原检查法。尚未有药典收载，欧洲药典将会收 载。l细菌内毒素检查法（BET)l医药工业普遍接受控制内毒素等于控 制热原。热原分类按检查法分l内毒素热原l革兰氏阴性细菌细胞壁的组分l非内毒素热原l除内毒素外的热原热原检查法（家兔法）可用于检测 上述两种原因产生的热原反应

2、。细菌内毒素检查法只检测产品的细 菌内毒素含量。试验验证未发现输液器材料的致热 性，临床发生的热原反应均为细菌内毒 素污染造成的。因此对输液器成品可采 用细菌内毒素检查法进行热原初试。热原通常是指能够致热的微生物的尸 体及代谢产物，主要是细菌的内毒素。细菌内毒素：主要存在于革兰氏阴性 细菌的细胞壁内，菌体裂解时释放出来。 是磷脂，脂多糖和蛋白质组成的复合物， 复合物中的脂多糖是内毒素的主要成分， 具有特别强的热原活性。热原的致热机理：细菌内毒素，病毒，细菌及其他微生物，类固醇或某些材料释放热原质，作用于动物体单核细胞，巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内生性热原，作用于下丘脑体温调节中枢，结果使动

3、物体温升高。热原反应给临床治疗带来极大的危害， 一般热原进入人体后数分钟至1小时内，即 会出现高热症状，反应严重者会造成死亡， 故必须严格控制。细菌内毒素的理化性质1 耐热性：180200摄氏度2小时干热可 完全破坏。（药典为250摄氏度至少1小时。 ）2 滤过性：体积极小，可通过普通滤器。3 水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水 冲洗以除去热原。4 不挥发性5 被吸附性：可被树脂等吸附除去。6 被酸碱破坏7 被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时， 可完全破坏。细菌内毒素生物活性l致热性l致死性l引起血液白细胞中的粒细胞下降l激活凝血系统l血压下降l诱导机体对内毒素的耐受l引起淋巴细胞的有丝分

4、裂l诱导抗感染的非特异性l杀死肿瘤细胞l与鲎试剂反应细菌内毒素检查法概述：1968年发现并创造了鲎试验，至今仍是国际上通用检测细菌内毒素的最简便有效的方法，其优点在于：1 科学性：有生物化学的理论基础。2 准确性：是酶的分子生化反应，专属性高，重现性强。3 灵敏性：鲎试剂和细菌内毒素的反应灵敏度极高，当内毒素量低到10-10g/ml浓度，它们 都能起凝胶反应，至今未发现一种物质对 鲎试剂的反应比细菌内毒素更灵敏。4 实用性：方法快速，操作简单，无 需特殊仪器设备，经济实用。由于细菌内毒素检查法的优越性，已 被广泛应用于临床检验。实验目的：据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集 反应的机理，以判断医疗器械

5、或其浸 提液中细菌内毒素的限量是否符合规 定的一种方法，医疗器械/材料须经热原实验评价证实无材料致热性，同时 经测定证实样品对细菌内毒素试验无 干扰作用后，才能采用该方法。实验原理细菌内毒素在钙离子，镁离子参与下，激活鲎试剂中c因子，活化的c因子激活b因子，活化的b因子激活凝固酶原生成凝固酶，促使凝固蛋白原生成凝固蛋白，在支联酶作用下形成凝胶。内毒素C因子活化c因子B因子活化b因子凝固酶元凝固酶凝固蛋白原凝固蛋白凝胶某些非热原物 质G因子活化g因子实验试剂：鲎试剂：是从栖生于海洋的无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。鲎试剂的生物活性以其能检出细菌

6、内毒素的最低有效浓度表示。鲎试剂的灵敏度是用细菌内毒素来标定的，因此标定鲎试剂灵敏度所用的细菌内毒素必须是统一且标准的。实验试剂l细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆 菌提取精制得到的内毒素，单位：EU.l用于标定细菌内毒素工作标准品和标 定，仲裁鲎试剂灵敏度。l细菌内毒素工作标准品：以细菌内毒 素国家标准品为基准进行标定，确定其效 价。具备均一性和稳定性。细菌内毒素检查用水：指与灵敏度为0.03EU/ML或更高灵敏度的鲎试剂在371条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。实验用具 移液管（或刻度吸管，定量移液器 ）、凝集管（1075mm）、三角瓶、 小试管（16100mm）、试管架、洗耳 球

7、、封口膜或金属试管帽、时钟、脱 脂棉、吸水纸、剪刀砂轮。所有玻璃 器皿须经180干烤至少2小时。塑料 用具应使用其它适宜的除细菌内毒素 方法。试剂 l75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液。 操作方法 l试验准备l洗液的配备 配制铬酸洗液或其他适 宜的细菌内毒素灭活剂。l玻璃器皿的洗涤 将洗涤的玻璃器皿 用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗 液中浸泡4小时，取出，用自来水将残余的 洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置 适宜的密闭金属容器中，置烤箱。除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素， 玻璃器皿置箱后将烤箱调至180，待烤箱温度升到设定的温度后开始记时，须干烤至少2小时。达到时间后，关断电源。待烤箱温

8、度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。塑料制品清洗干净后在30双氧水中浸泡4 h，再用无热原水充分冲洗后在60烘箱中烘干备用 。鲎试剂灵敏度复核 l内毒素标准溶液的制备l 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落 入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒 精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。l 按标准品使用说明书用移液管加入规定 量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严 。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需 浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0、1.0 ,0.5 , 0.25（为所复核鲎试剂的标示 灵敏度），每稀释一步均

9、应在旋涡混合器上混合 30秒（详细过程请参见使用说明书）。示例l例如使用NSE(内毒素含量为9000EU/支)时 的方法如下：l溶解：准确吸取BET水1ml加入NSE的安瓿内 ，用封口膜 将瓶口封严，置旋涡混合器混合15 分钟，即为9000EU/ml内毒素标准溶液。l稀释：取0.3ml内毒素标准溶液加上2.7ml BET水即为110稀释液，得到900EU/ml内毒素标 准溶液。取0.3mL 110稀释液，加上2.7mL BET水即为1100稀释液，得到90EU/ml内毒素标准溶液。往后依次类推。也可写成下列格式：l9000EU/ml 900EU/ml 90EU/ml 9EU/ml 1EU/ml

10、 0.5EU/ml 0.25EU/ml 0.125EU/ml 0.0625EU/mll在上述稀释过程中，每稀释一步，均须旋涡混合器上混合30秒钟。0.3ml2.7ml2.4ml0.3ml1ml1ml待复核鲎试剂的准备 l在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈处轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，加入0.1mlBET水，使鲎试剂充分溶解，避免产生气泡。l若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水溶解，将溶解后的鲎试剂溶液混匀后每0.1ml分配到1075mm凝聚管中，要求至少分配18管备用。加样将已充分溶解的待复核鲎

11、试剂18支(管)放 在试管架上，排成5列，其中4支(管)4列 分别加入2.0、1.0、0.5、0.25 的内毒素标准溶液；2支(管)1列分别加入 BET水，作为阴性对照。内毒素标准溶液 和BET水加样量均为0.1ml/支。加样结束后，用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37摄氏度水浴中，试管架保持水平状态，保温602分钟.结果判定：将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转 180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱 者为阳性，记录为（）；凝胶不能保持完 整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（）。鲎试剂灵敏度复核如最大2.0浓度管均为阳性，最低浓度 0.254管均为阴性，阴性对照为阴性， 按下式计

12、算反应终点浓度的几何平均值即为 鲎试剂灵敏度的复核结果（c）。 clg-1(X/4) 式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。反 应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后 四个呈阳性的结果浓度。结果记录阴性0.50.250.1250.0625-+-+-+-+-举例计算内毒素稀释释液浓浓度d(EU/ml)X(lgd)0.25-0.602060.25-0.602060.25-0.602060.5-0.30103举例计算lX=2.10721l=lg-1(-2.10721/4)=0.297l测定值在标示值的50%200%之 间，所标示灵敏度可被确认，此批鲎 试剂可用于供试品的细菌内毒素检查 。l内毒素

13、限值的确定l一次性使用输液器内毒素限值为 20EU/套（GB/T14233.2-2005)供试品细菌内毒素的检查 供试品细菌内毒素的检查 l供试品溶液的制备l每批输液器取3套，管内腔注入细菌内 毒素检查用水10mL，反复荡洗5次后，两 端封闭，置37 下 2h，将腔内的液体倒入 一无菌无热原玻璃容 器内。l举例：所用鲎试剂标示灵敏度为 0.25EU/ml,则阳性对照溶液的细菌内毒素 浓度为0.5EU/ml.l阳性对照溶液的制备 用细菌内毒素 检查用水制成2浓度的细菌内毒素溶液。试剂制备l鲎试剂制备l在制备供试品溶液、内毒素标准溶液 的同时，取0.1ml/支的鲎试剂6支，手指轻 弹瓶壁，使颈部瓶

14、壁上的粉末落入瓶内， 用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦 拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加 入0.1ml/支水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容 物充分溶解，避免产生气泡。l若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支 时，按标示量加入BET水复溶，将溶解后 的鲎试剂液混匀后每0.1ml分配到1075m m凝集管中，要求至少分配6管备用。 供试液的稀释l使用鲎试剂的灵敏度标示值小于供试 品的细菌内毒素限量时，用检查用水将供 试液稀释后进行试验，公式如下：l供试液稀释倍数=X/ lX供试品的细菌内毒素限量l使用鲎试剂的灵敏度标示值加样 l取装有0.1ml鲎试剂溶液的1075mm试管或 复溶后的0.1m

15、l/支规格的鲎试剂原安瓿8支。l2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供 试品溶液作为供试品试管。l 2支加入0.1ml 2浓度的内毒素溶液作为阳 性对照。l2支加入0.1ml BET水作为阴性对照。l2支加入0.1ml 含2浓度的内毒素的供试品 溶液作为供试品阳性对照加样编号内毒素浓度/配制内毒素的溶 液平行管 数 A无/供试品溶液2B2/供试试品溶液2C2/检查检查 用水2D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为供试品阳性 对照；C为阳性对照；D为阴性对照l将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜 封闭管口，垂直放入371水浴或适宜恒 温器中，试管保持水平状态保温602分钟 。保温和拿取试管过程应避免震动。 结果判断l将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转 180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱 者为阳性，记录为（）；凝胶不能保持 完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（ ）。 结果判定l阳性对照2管应均为（），l供试品阳性对照2管应均为（） ，l阴性对照2管应均为（）。l否则实验无效。结果判定l供试品2管均为(),判定该批产品符合本法 规定。l供试品2管均为（），则判定该批产品 不符合本法规定，或再进行热原检查法试验。l如只有一管为阳性则按上述方法另取四支 供试品管复试，四支中有一支为阳性则不符合 规定，或再进行热原检查法试验。