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1、酵母双杂交基本思想1 酵母双杂交由Fields在1989年提出. 他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究.2 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD).1 DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4- responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合。 AD则通过与转录机构（t
2、ranscriptionmachinery） 中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游 的基因进行转录. 2 DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反 应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完 整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子 ，使启动子下游基因得到转录.基本原理1、细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。2、转录激活因子在结构上是组件式的（modular）, 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域（DNA binding domain，简称为BD）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是
3、转录激活因子发挥功能所必需的。3、 BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的目的基因的转录。4、二个结构域可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。5、不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。6、酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达，探测蛋白蛋白的相互作用。编码一个蛋白的基因融合到BD；另一个蛋白的基因融合到AD。7、Fields建立的双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL
4、4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录。一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait)，X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey）。8、目前,常用BD基因有：GAL4（1-147）; LexA (E coli转录抑制因子）的DNA-bd编码序列。常用的AD基因有：GAL4（768-881）和疱疹病毒VP16的编码序列等。9、双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因（reporter gene）的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：1 易于转化、便于回收扩增质粒。2 具有可直接进行选择的标记基因和特征
5、性报道基因。3 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。应用发现新的蛋白质和蛋白质的新功能在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响建立基因组蛋白连锁图特点和优点酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点： 作用信号是在融合基因表达后， 在细胞内重建转录因子的作用而给出的， 省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 检测在活细胞内进行， 可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应， 因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的
6、或暂时的相互作用。 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。局限性及存在的问题 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。1)由于某些蛋白本身具有激活转录功能。在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活
7、转录。2)某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生“假阳性“结果。(3)在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题，但也应予以重视。造成假阴性的原因主要有两方面。 （1）是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时 应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载 体。 （2）是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏 感的菌株及多拷贝载体。常见问题的解决方案1、为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告
8、基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同，这可减少大量的假阳性。另外，报告基因通常整合到染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。2、即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析： （1）这种相互作用是否会在细胞内自然发生，即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。 （2）某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。 （3）一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体（motif）如两
9、个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。酵母双杂交的优化(1)在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a接合型和接合型，这两种单倍体之间接合（mating）能形成二倍体，但a接合型细胞之间或接合型细胞之间不能接合形成二倍体。Bendixen等人根据酵母有性生殖的这一特点，他们将文库质粒转化接合型酵母细胞，“诱饵”表达载体转化a接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔（lawn），再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上，原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。相互作用转印(2) Vid
10、al等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system）。这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。Vidal等人在URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。相互作用不相互作用缺乏尿嘧啶的培养基在含有5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干
11、扰不再相互作用，URA3基因不表达，则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。不相互作用相互作用含有5-FOA的完全培养基（3）酵母双杂交实验转化效率太低，可以采用以下方法解决：1) 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。2) DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。3) 培养基不适当，重新配制培养基，并做对照转化。4) 检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/Trp平板上，转化效率应该在1 x 105 colonies/mg DNA以上。应用酵母双杂交系统对Prp蛋白与 shadoo蛋白互作的研究1诱饵质粒的构建2猎物质粒的构建3诱饵质粒与猎物质粒的可行性检验及互作4结果
12、分析PRP蛋白：朊蛋白 PRNP：朊蛋白基因 Shadoo蛋白：与朊蛋白在N端结构上及其相 似的新蛋白 SPNR：Shadoo蛋白的结构基因1 诱饵质粒的构建(1)引物设计(2)PRNP基因的PCR扩增(3)PCR产物的回收(4)pMD18-T-PrP系列重组质粒的构建及鉴定(5)重组诱饵质粒psos-PrP系列的构建及鉴定（1）引物设计设计上游含有BamH 1酶切位点的引物序列下游含有SaH1酶切位点的十二个不同引物序列（2）PRNP基因的PCR扩增提取Balb/c小鼠肝脏基因组作为模板进行PCR,模板4L,引物各1L,dNTP4L，Ex-Taq 0.5L,dH2O 12L,Ex-Taq B
13、uffer 2.5L;按95预变性5min,9430s;6530s;7230s,循环30次扩增;最后72延伸10min, 反应结束后经1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分 析鉴定（3）PCR产物的回收柱离心式琼脂糖胶DNA纯化回收试剂盒，PCR产物的回收经1.0%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察电泳结果并拍照，将DNA贮存于-20(4)pMD18-T-PrP系列重组质粒的构建及鉴定A) PCR产物与pMD18-T载体的连接将各段PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,使用凝胶回收试剂盒回收,按T载体试剂盒操作说明分别与pMD18-T载体连接,4连接20h,连接体系：pMD18-T载体0.5LPCR回收产物
14、4.5LSolution 5.0L总体积10LB ) DH5a感受态细胞的制备用CaCl2法制备DH5a感受态细胞,方法如下: l)配制0.05mol/L CaC12 15%甘油混合溶液,高温高压灭菌;实验所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净,高温高压灭菌;2)从LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5mL LB液体培养基, 37振荡培养过夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50-100mL LB液体培养基中,37振荡培养2.5小时至OD600=0.5;3)细菌的收获:培养液冰浴5分钟后,4/5000g离心5分钟;4)用预冷去离子水洗涤沉淀(然后冰
15、浴几分钟比较好), 4/5000g离心4分钟;5)沉淀加入2mL预冷的0.05mol/L CaC12 15%甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟, 4/5000g离心5分钟;6)沉淀加入2mL预冷的0.05mol/LCaC1215%甘油混合溶液,轻吹散即成为感受态细胞悬液,分装成50-100L的小份,贮存于-80,保存半年。C) 感受态细菌的转化1)将DH5a感受态细胞从-70冰箱中取出,立即置于冰水中,10min融化;2)将10L连接产物加入DH5a感受态细胞溶液中(超净工作台进行),轻轻吹打混匀,冰浴30min。42水浴热激2min,此时切忌振荡,之后立即放入冰水中2min,再37水浴5min
16、;3)将37预热的液体LB培养基800L于转化的 菌液中,37 110r/min振荡培养45min。4)此间制备LB抗生素琼脂平板,取出50预热的灭菌的LB琼脂培养基按终浓度50g/mL加入 Ampr 抗生素,摇匀切忌产生气泡,将培养基倒入灭菌的平皿中,1520mL/平皿。2min后凝固,盖上平皿作好标记备用;5)将37培养40-60min的转化菌液在超净工作台中,每平皿100L菌液的量轻轻加到己凝固的LB琼脂培养基表面,应用无菌玻璃涂布器涂匀,37培养箱放置几分钟(约10min),待液体吸收后,倒置培养过夜12-16h,直至出现转化菌落。D) 重组质粒的小量提取按 Vitagene生物公司开发的柱离心式琼脂糖凝胶DNA质粒小量提取试剂盒进行操作,将所提质粒DNA在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,紫外灯下观察质粒提取情况并拍照,并贮存于-20E) 重组质粒的鉴定将经过电泳筛选出的可疑阳性克隆质粒进行BamHI和Sall双酶切反应，37度酶切2h10
