乙型肝炎血清学诊断新进展

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1、南方医科大学南方医院 侯金林南方医科大学南方医院 侯金林乙型肝炎血清学诊断新进展乙型肝炎血清学诊断新进展肝功（肝功（肝功（肝功（LFTLFT） 血清标志物血清标志物血清标志物血清标志物 HBV DNAHBV DNA YMDDYMDDcccDNAcccDNAHBV mRNAHBV mRNA内质网内质网内质网内质网高尔基体高尔基体高尔基体高尔基体HBV 复制周期复制周期(Replication cycle of HBV)DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶胞核胞核肝细胞肝细胞HBsAgHBsAgHBeAgHBeAgHBV DN

2、A血 清血 清耐药突变耐药突变cccDNAcccDNAHBV mRNAHBV mRNA内质网内质网内质网内质网高尔基体高尔基体高尔基体高尔基体HBV 复制周期复制周期(Replication cycle of HBV)DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶胞核胞核肝细胞肝细胞HBsAgHBsAgHBeAgHBeAgHBV DNA血 清血 清耐药突变耐药突变HBsAg 我们了解什么? HBsAg 最早标志， 经典，简单? 易检测，难清除 未知不少: 清除机理？半衰期？EM回归血清学回归血清学?HBsAg 我们了解什么? HBs

3、Ag 最老标志， 经典，简单? 易检测，难清除 未知不少: 清除机理？半衰期？EM回归血清学回归血清学?量 基因型/亚型 变异体 肝组织/血清浓度的比例HBsAg定量检测的应用一、了解影响血清HBsAg水平的因素二、了解抗病毒治疗下血清HBsAg的 动态变化特点HBsAg与HBV DNA水平正相关B基因型的HBsAg水平更高独立影响血清HBsAg水平： HBV DNA 和基因型多元回归分析结果多元回归分析结果 (n=457) factors regression coefficientstandard error 95% CI t valuep valueAge -0.009 0.006 (-

4、0.020)-0.003 -1.5160.131 HBeAg 0.197 0.154 (-0.107)-0.500 1.2770.203 HBV DNA 0.138 0.034 0.070-0.206 4.0190.001Genotype -0.292 0.117 (-0.522)-(-0.061)-2.4980.013 R2 0.208 基因型C: 肝内HBsAg水平更高HBV/C: HBsAg转运障碍？基因型HBsAg转运临床结 局？基因型基因型C感染感染肝内肝内HBsAg滞留滞留肝细胞对细胞因子引起的损伤更敏感1HBsAg转运障碍？肝细胞表面内源性肽高水平递呈2内质网压力（ER stre

5、ss)增高3基因基因C型患者肝脏损伤更严重型患者肝脏损伤更严重1, Kalinina, et al. Hepatology, 2001 2, Gilles, et al. Hepatology, 1992 3, Xu, et al. J Virol, 1997HBsAg的动态变化入选标准1. HBeAg阳性2. 拉米夫定长期治疗，之前无抗HBV治疗；3. 病毒抑制快速：治疗24周HBV DNA阴性4. 病毒抑制持久：HBV DNA阴性持续至156周基线资料表表 2、HBeAg 转阴或持续阳性患者基线的临床和病毒学资料比较转阴或持续阳性患者基线的临床和病毒学资料比较 HBeAg 转阴组转阴组 (

6、N=26) HBeAg 持续阳性组持续阳性组 (N=19) p 值值性别 （男/女）20/6 14/5 1.000年龄* （岁） 26 (18-48) 28 (21-36) 0.201ALT*（ULN） 3.42 (1.35- 13.65) 3.49 (0.67-27.71) 0.435HBV DNA*, (lg)8.89 (6.19-12.51) 9.09 (5.44-10.28) 0.626HBsAg*, (IU/ml)7068.9 (538.9-124990.0) 9382.2 (478.6-91783.4) 0.615基因型 (B/C) 13/13 8/11 0.764*：数据以中位数

7、（范围）表示。ULN：正常值上限（40 U/L） 。 HBsAg动态变化特征 与HBeAg转阴与否无关基因型影响HBsAg的变化特点个体患者HBsAg变化的主要类型cccDNAcccDNAHBV mRNAHBV mRNA内质网内质网内质网内质网高尔基体高尔基体高尔基体高尔基体HBV 复制周期复制周期(Replication cycle of HBV)DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶胞核胞核肝细胞肝细胞HBsAgHBsAgHBeAgHBeAgHBV DNA血 清血 清耐药突变耐药突变HBeAg定量检测 亚培公司曾经提供过

8、HBeAg定量检测服 务，但目前没有商品化的HBeAg定量试 剂cccDNAcccDNAHBV mRNAHBV mRNA内质网内质网内质网内质网高尔基体高尔基体高尔基体高尔基体HBV 复制周期复制周期(Replication cycle of HBV)DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶胞核胞核肝细胞肝细胞HBsAgHBsAgHBeAgHBeAgHBV DNA血 清血 清耐药突变耐药突变HBV cccDNA HBV共价闭环(covalently closed circular, ccc)DNA是前基因组(pg)RNA合成的

9、模板。 是病毒复制的模板, 其数量决定病毒复制 水平, 宿主免疫控制肝细胞的cccDNA数 量, 肝内病毒复制和清除强度的平衡表现 为血清病毒水平。HBV cccDNA的定量 均依据松弛环状DNA和cccDNA在结构上 的差异而设计，一些报告还采取酶消化 的附加步骤以减少松弛环状DNA相对于 cccDNA的比例以增加特异性 过高估计cccDNA水平, 有些方法甚至可 以检测到血清中极高拷贝数的HBV cccDNA不准确,不标准,不实用 HBV cccDNA的定量检测方法在特异性的提高 上仍有空间； 同时采用目前的HBV cccDNA定量方法可能会 对HBV生活周期的认识以及抗病毒治疗的策略 制

10、定产生误导，值得警惕 肝脏活检的不普遍性，HBV cccDNA定量的临 床应用目前仍不现实。cccDNAcccDNAHBV mRNAHBV mRNA内质网内质网内质网内质网高尔基体高尔基体高尔基体高尔基体HBV 复制周期复制周期(Replication cycle of HBV)DNADNA 依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶 RNARNA依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶依赖聚合酶胞核胞核肝细胞肝细胞HBsAgHBsAgHBeAgHBeAgHBV DNA血 清血 清HBV DNA 检测斑点杂交 （Dot-blot hybridization）非PCR定量（Non-PCR based qua

11、ntitative HBV DNA assays定量 PCR-based quantitative HBV DNA assays1980s1990s2000s血清HBV DNA定量 方法目前多以聚合酶链式反应（PCR）作为检测手段； HBV DNA定量的表达多以拷贝/毫升（copies/ml）或国际 单位/毫升（IU/ml）表达，二者之间粗略的换算方法为1 IU/ml = 5 copies/ml。 血清HBV DNA定量检测的发展方向为更高敏感性 （sensitivity）和更宽的动态范围（dynamic range）。血清HBV DNA定量 方法目前多以聚合酶链式反应（PCR）作为检测手段；

12、 HBV DNA定量的表达多以拷贝/毫升（copies/ml）或国际 单位/毫升（IU/ml）表达，二者之间粗略的换算方法为1 IU/ml = 5 copies/ml。 血清HBV DNA定量检测的发展方向为更高敏感性 （sensitivity）和更宽的动态范围（dynamic range）。Minor fluctuation或minor rebound 例如罗氏公司的Cobas Taqman（敏感性为60IU/ml，动 态范围可至108IU/ml)，目前刚完成或正在进行的临床 试验多采用此方法，并将HBV DNA下降速率作为疗效 的评价指标。 亚培公司的RealTime方法的检测范围与前者类

13、似，检 测下限可达10 IU/ml。 更早地监测到接受抗病毒治疗患者血清HBV DNA的波 动甚至是反弹（minor fluctuation或minor rebound），不同试剂不同试剂HBV DNA检测范围检测范围1021031041051061071081091010Ultrasensitive Digene IICobas AmplicorVersant HBV DNA 3.0HBV DNA (copies/ml)Digene IIbDNANAXCORCobas TaqMan国产试剂盲区国产试剂盲区(无天无天, 无地无地,无标无标,无法无法,)High prevalence of ge

14、notype recombinations in ChinaN=1096; from 9 centersC,BB,CB,C, C/D, DZeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH J General Virology 2005C:77%B: 59%B: 23%C:41%D,C/D 29%B, C 71%C6, C7?HBV Genotypes and subgenotypes in ChinaPure B (Bj strain)Pure DC/D Hybrid (C6)Pure C (C1, C2)B/C hybrid (Ba strain)EcoR I

15、 siteHBV Genome03200GenotypesSPreC/Cnt1742 2495nt10 799For GenotypingaywadraywadwadwZeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH. J General Virology 2005nt10 1499 aywC/D Hybrid (C7)HBV Genotypes and subgenotypes in ChinaPure B (Bj strain)Pure DC/D Hybrid (C6)Pure C (C1, C2)B/C hybrid (Ba strain)EcoR I siteHBV Genome03200GenotypesSPreC/Cnt1742 2495nt10 799For GenotypingaywadraywadwadwZeng GB. J Viral Hepatitis 2005; Wang ZH. J General Virology 2005nt10 1499 aywC/D Hybrid (C7)Ox head and body but horse face (牛头马面牛头马面)CD B C D In