酵母菌中多倍体基因组的基因分析

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1、酵母菌中多倍体基因组的基因分析酵母菌中多倍体基因组的基因分析多倍体，即染色体成套的增加，在发育，细胞应激，疾病和进化中出现。尽管多倍体 现象很普遍，但很少有人了解伴随着多倍体的生理变化。我们之前描述过“多倍体特异性 致死” ，在单倍体或二倍体出芽酵母不具有致死性的基因缺失对于三倍体或者四倍体酵母来 说却具有致死性。这里我们研究基因组是为了明确多倍性特异性致死的作用。在被检测的 3740 个突变中只筛选出 39 个表现出多倍体特异性致死现象，几乎所有的突变都是通过损 害同源重组、姐妹染色单体的结合或者有丝分裂纺锤体的功能来影响基因组的稳定性的。 我们发现被检测的野生型四倍体的缺陷，并且明确了四倍

2、体影响基因组稳定性的机制。我 们发现四倍体有较高的发生率去附着纺锤体的单极，我们认为这个缺陷可以用错配来解释 以扩大纺锤丝极体、纺锤体和着丝粒的限度，因此，几何约束可能对基因组的稳定产生深 远的影响，在这里描述的现象可能与多种多样的生物演化关系相关，包括像癌症这样的疾 病。 多倍体在自然界中很常见，所有生物体的多倍体现象发生在植物，真菌，无脊椎动物 以及像鱼和两栖动物这样的低等脊椎动物中。原因尚不清楚，但多倍体在高等脊椎动物中 是不能存活的，我们认为多倍体现象在进化中也经常发生。基因组序列表明，很多同时代 的基因组，包括高等脊椎动物的基因组，是由原始的基因副本进化而来，保存了基因顺序 和方向的

3、复制的基因组片段在很多酵母菌和人类的基因组都是很明显存在的，这些发现与 Ohno 的假设是一致的，这个假设是：基因复制产生了进化多样性的基础。 多倍体也会在另外一些整倍体有机体的一小部分细胞中发生。在绝大多数环境下，细 胞在特定的机制核内周期的作用下会变成多倍体，它截断了细胞周期并且阻止了 细胞分裂。然而，一些细胞类型，像肝细胞，能够像多倍体细胞一样分裂，并且很多细胞 类型在病态的情况下变成多倍体，以便在病毒感染之后或者处于像癌症这样的病态时对细 胞应激做出反应。因此，多倍体只出现在特定的细胞类群以及生理环境下，至少在发育过 程中，存在一些机制来限制多倍体细胞的分裂。 多倍体具有一些潜在的优势

4、。伴随体积的增大，多倍体可提供代谢方面的好处。比如， 大肠杆菌在限制营养素的环境中能够自发地变成多倍体，原则上基因重复能够保护多倍体 细胞防止有害的突变，尽管在测试时，它不能抵抗 DNA 破坏性物质。然而，多倍体也有代 价，特别地，新组建的多倍体经常显现在保持基因稳定方面的缺陷。四倍体出芽酵母在 DNA 破坏机构或者微管动摇药物的处理后表现出较高比率的染色体损失以及较高水品的突 变和重组，在很多四倍体动物细胞中，可以发现在胞质分裂失败或细胞融合后出现的不正 常的有丝分裂导致的染色体错误的分离。基因不稳定的四倍体细胞可能促进肿瘤发生，这 个观点是我们最近用老鼠乳腺上皮肿瘤发生的模式确定下来的，新

5、形成的多倍体细胞基因 组的不稳定能够加速新的变体的产生，在生物进化以及肿瘤形成发挥的作用之间增加平行 分支。 尽管基因组的不稳定通常与多倍体相联系，潜在机制我们并不了解，更广泛地说，伴 随着多倍体生理变化的范围还不是很清楚。我们以前识别的遗传现象，为我们提供了一条 探寻这些问题的实验的道路，我们发现编码微管/着丝粒结合蛋白 Bikl 的基因的缺失会导致 “多倍体特异性致死” ，但是 Bikl的单倍体或是二倍体是可以存活的。多倍体特异性致死 现象表明伴随着多倍体会发生显著的生理变化，定义生理变化的第一步来自多倍体，我们 设计了基因组策略来鉴别多倍体特异性致死作用，检测结果揭示了四倍体细胞有一个强

6、大 的特定的对一小组涉及维持基因组稳定性的基因的需要。四倍体细胞最显著的缺陷在有丝 分裂时，我们认为有丝分裂的缺陷能够至少一部分由纺锤体组分大小不匹配来解释，因为 几何约束自然减少了染色体分离的准确度。多倍性特异性致死的基因检测多倍性特异性致死的基因检测 我们开发出一个策略来制造出芽酵母菌株二倍体纯合子基因缺陷组成的四倍体衍生物。 基因替换盒是用来删除接合型 MATa 或者 MAT 位点将不接合的 MATa/ 转变成具有接 合能力的 MATa/或者 MAT/ 双倍体，从它们中我们可以筛选出四倍体。 使用这个策略，我们从存活的 4766 个双倍体纯合子基因缺陷中获得了 3421 对MATa/ M

7、AT/ 缺陷菌株（占可存活的酵母基因缺陷的 71.8）并通过两两配对来分 析。我们识别出了酵母菌四倍体存活所需的 17 个基因，缺少这些基因的多倍体特异性致死 已经被质体交换的方法独立地验证，这就证明了突变菌株在鉴定中得分，是因为四倍体的 致死性和降低了的适应性而不是因为杂交的缺陷。 至少两类突变不能由我们的方法得到：必需基因和缺少同源重组的突变（由于 MAT 位 点的无效的替换） 。我们因此使用了质粒交换的方法来构建四倍体菌株。对于必需的基因， 我们注重由基因组检测识别出来的功能相关的基因，因此对这些基因的特征描述就不具有 广泛性。我们分析了热敏突变在不同中温下的生长缺陷。这些方法综合起来我

8、们从 3540 个 基因中识别出 39 个基因，这些基因是对四倍体酵母菌株的存活来说是必需的。典型的基因 缺陷也在不同压力环境下多倍体特异性致死类型中检测出来，这些分析证明了多倍体特异 性致死在 Saccharomyces cerevisiae 来说是一个普遍现象，我们将参考所有突变，不管是在 四倍体中具有致死性还是导致热敏生长的，都作为多倍体特异性致死突变。 在四倍体酵母菌中，对某些特定基因的强烈需求不可能是由于基因表达中多倍体特异 性的变化。野生型 MATa/ 二倍体的第三份样本和 MATa/a/ 四倍体的比较不能解释 二倍体和三倍体在基因表达方面显著的不同，这是从选择蛋白所用的不变的蛋白

9、水平的特 征描述来确定的。这个结果表明一定有潜在的其他机制，不同于我们在四倍体中观察到的 特定的变化，引起我们对野生型二倍体和四倍体细胞基因组稳定性的详细比较。 四倍体中基因组的稳定性四倍体中基因组的稳定性 很显然，多数多倍体特异性致死基因形成三种功能群：以同源重组来修复 DNA 损伤所 需的基因，姐妹染色单体结合成立与解除所需的基因，以及一小群有丝分裂纺锤体正常作 用所需基因。这些基因不仅仅涉及到基因组稳定性的维持上，而且这些基因之间也具有广 泛的遗传性相互作用。这些基因之间功能的相互联系被我们进一步的遗传性分析所证实。 多倍体特异性致死突变中非常小的特殊的群组表明改变了的基因组的稳定性是多

10、倍体出芽 酵母中主要的生理学变化。 接下来我们使用遗传性试验来系统地分析野生型多倍体基因组稳定性的特征。通过检 测酵母人造染色体的分离，我们观察到四倍体相比于二倍体染色体缺失的速度增加了 200 倍，这与之前的结果是一致的，证明了染色体错误分离在酵母菌四倍体中显然是很常见的。 尤其是相比二倍体，四倍体表现出同源染色体之间基因交换频率的增加（被检验为两种异 等位基因的重组） ，此外，我们在分析酵母菌人造染色体标记基因的重排的试验中观察到了 总的染色体重排频率小的但很重要的增长，比较之下，正向突变率和姐妹染色单体交换的 频率在二倍体和四倍体细胞中是非常相似的。总的来说，相比于二倍体，四倍体表现出大

11、 量的染色体的缺失以及变化了模式的重组，但是没有表现出一般的“高度重组” ，以及高度 突变的表现型。四倍体的药物敏感对比曲线与这些发现是一致的。与二倍体比较起来，野 生型四倍体对双链断裂诱发性物质与微管毒物苯来特的敏感度表现出 5 到 10 被的增加，但 是对压力，紫外管线或者放射性破坏不是很敏感。 四倍体为了存活下来要进行同源重组四倍体为了存活下来要进行同源重组 单倍体和二倍体酵母，不同于动物细胞，不需要为了存活而进行同源重组，但是四倍 体最突出的需要就是同源重组基因，从而显现出加高水平的自发 DNA 损害，尤其是要假设 细胞周期特别是 s 期的时间不随倍数的增加而增加。能够被同源重组修复的

12、 DNA 损害的主要来源之一是 DNA 复制，一种可能性是没有任何 DNA 复制缺陷的，增加了数目的成套染 色体能够制造足够的自发的 DNA 损伤，从而满足了同源重组的强大的需求。 为了检验这个假设，自发的 DNA 损伤能够通过双倍体或者多倍体表达 Ddcl-GFP 融合蛋 白中被直接看到。Ddcl 是 9-1-1 化合物的组成成分，在 DNA 损伤的早期出现。在单倍体中， Ddcl 焦点在 s 期出现并且在细胞分裂的后期消失，与我们的假设相一致，具有 Ddcl 焦距的 处于 S 期的细胞数目（小的胚细胞）与细胞多倍体的倍数呈比例，不管在每个细胞中焦距 数目还是具有焦距的细胞的比例上，我们都观

13、测到了 1N，2N 和 4N 细胞数目分等级的增加， 这与减数分裂的细胞相对比，这些细胞中四倍体的 Ddcl 焦距比预期要高（按照染色体含量 来看） 。这表明了细胞分裂期持续的 DNA 损伤以及发生在细胞分裂中或者是次级细胞群中 额外的 DNA 损害，被短暂地阻止，来修复 s 期中所需要的基因的损伤。 为了进一步地检测这个观点：染色体组数目的增加与自发地 DNA 损伤成比例，我们 检测了不同倍体的同基因型的细胞（缺少 Rad52） ，Rad52 在出芽酵母同源重组中需要。仅 仅一组双链的断裂就会激活 DNA 损伤检查点，致使细胞周期停滞在 rad52，如果在 s 期， 一小部分细胞需要自发的不

14、能被修复的双键断裂，那么 rad52菌株的生长缺陷就可以被 解释。缺少 Rad52 的四倍体细胞在 240生长缓慢，在 30下是不能存活的，因此增加的 多倍体的组数也能成比例的增加自发的双链断裂的细胞的数目。可能绝大多数在 37的四 倍体细胞获得了一种损害，这种损害需要同源重组才能修复。与我们的假设一致，缺少 Rad52 的细胞转换到 37时会在 s 期之前被阻止为一种大的发芽细胞，但在 s 期完成之后 发生的温度转变将不会发生这种现象。 为了直接验证这个假说，小的出芽 rad52和控制细胞被显微操纵技术分离，并且在 随着细胞周期前进的时间中被检测，在 30（这个温度可以对 rad52四倍体半

15、许可） ， 99的野生型 2N，3N，和 4N 细胞在 4 小时内完成细胞周期，相比之下，17的 2N，28的 3N 和 48的 4N 的 rad52细胞经历了更为长期的细胞周期。有形态学表明， DNA 损伤位点的活性，被阻止的细胞的线性增加支持了这一观点，具有自发的 DNA 损伤的 细胞数目的增加与多倍体倍数成正比。 与这个假设一致，我们不能在其他过程中检测出缺陷，这个过程可以另外产生一些双 键断裂。野生型四倍体经过很多世代后产生了许多长的染色体终端，与二倍体的相同。我 们并没有观察到四倍体细胞周期前进过程和 DNA 复制过程的其他主要的缺陷，都通过从同 步的细胞孤立出来的染色体的流式细胞术

16、和脉冲区的电泳。我们也没有在四倍体中观察到 对诸如 Cdc7、Cdc6 或者 Pol32 这样的复制蛋白的更多的需要。综合考虑，这些结果阐明 了一个“生死攸关”的门槛是如何通过增加染色体的数目来交叉到其他种群的细胞中去的。 因此酵母菌中的四倍体产生了一种这样的情景：就像在动物细胞观察到的那样，同源重组 对于 s 期的完成是非常必要的。 四倍体姐妹染色单体结合的必要条件四倍体姐妹染色单体结合的必要条件 接下来我们将介绍四倍体细胞中姐妹染色单体结合的必需条件，这首先决定了野生型 的四倍体细胞是否具有结合缺陷。姐妹染色单体结合被检测到在不同染色体 IV 位点上发生， 通过诺考达唑阻止的细胞的 GFP 荧光实验。我们观察到尽管在阻遏中野生型二倍体细胞保 留了姐妹染色单体的结合，但是多倍体细胞保持了小的但是明显的结合缺陷（在诺考达唑 阻遏中姐妹染色单体分离发生率提高了三倍）显然，在受到诺考达唑影响后，四倍体与二 倍体一样有效地表现出停滞现象，并且在实验中一直处于停滞状态。在被识别的多倍体特 异性致死基因的许多单倍体的缺失也被认为是有