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1、上海交通大学基础医学院硕士学位论文（2008）中文摘要标题:高频电刺激对 PC12 类神经细胞形态结构及功能的影响作者:沃雁导师:丁文龙高频电刺激对 PC12 类神经细胞形态结构及功能的影响摘 要目的：研究细胞外高频电刺激（high frequency stimulation，HFS）对 PC12 类交感神经细胞的形态结构及细胞内 Ca2+、cPKC 和自身 P-PKC的影响，为深入探讨细胞内 Ca2+影响 T H 的表达提供相关实验数据。方法：将HFS作用于传代PC12类交感神经细胞株，HFS参数为：刺激频率130 Hz，通过电流500 A，脉冲宽度60 s；每天固定时间刺激3 h，持续3
2、d。对照组HFS为零。分别用H E染色、免疫组织化学方法检测经HFS后PC12类交感神经细胞在光镜下形态结构的变化；应用激光共聚焦扫描显微镜观测即刻HFS前后以及连续3 d HFS停止前后单个PC12类神经活细胞内Ca2+动态变化，并通过L型电压敏感钙通道阻滞剂尼非地平（nifedipine，NIF）以证实HFS可引起PC12类神经细胞内Ca2+变化；通过 Western Blot方法检测 HFS后， NIF对经典蛋白激酶 C（ conventionalI上海交通大学基础医学院硕士学位论文（2008）中文摘要protein kinase C，cPKC）及其自身磷酸化蛋白激酶C（Phospho-
3、PKC (II)，P-PKC）在PC12类神经细胞内表达的影响。结果：与对照组比较，HFS后PC12类神经细胞光镜下突起长度显著缩短，突起个数明显减少（P0.05；Compared beforewith after terminating 3-day HFS the intracellular Ca2+ fluorescence intensity P0.05.2.3HFS后NIF对PC12细胞内Ca2+影响结果加入浓度为 2 M 的 NIF，于刺激即刻前孵育 5 min 后，接入 HFS，刺激开22始前后细胞内荧光强度变化不明显（图 3-A、B），通过线扫描和面扫描两种扫描方式观察细胞内荧光
4、强度随刺激时间延长下降不明显（图 4、5），幅度分别仅为4.8 %和 0.3%，分别与对照组比较均有显著差异 P0.05（表 1）。提示 NIF 抑制了由即刻HFS 引起的细胞内 Ca2+外流的作用。图 3：HFS后 L型钙通道阻滞剂 NIF对 PC12类神经细胞内 Ca2+的影响 A： HFS前；B： HFS后；C：3 d HFS停止前； D：3 d HFS停止后；Fig 3：The effect of L-voltage sensitive Ca2+ channel blocker NIF on intracellular Ca2+ in PC12sympathetic neurocyte
5、s after HFSA：Before commencing instant HFS；B：After commencing instant HFS；C：Before terminating3-day HFS； D：After terminating 3-day HFS；2.4连续3 d HFS 对PC12细胞内Ca2+变化结果HFS 的 3 d 组，停止电刺激后，胞内 Ca2+荧光强度逐渐加强（图 2-C、D），23Intensity随刺激停止，线扫描和面扫描两种扫描方式均可以观察到胞内 Ca2+荧光强度迅速上升（图 7、8）幅度分别达 60 %和 3.5 %（图 9），尽管线扫描间隔时间短，
6、速度快会使荧光湮灭，但仍以线扫描荧光强度上升更为显著，考虑与扫描的方式有关，面扫描刺激停止前后 Ca2+荧光值比较结果有显著差异 P0.05（表 1）。提示 NIF 抑制 HFS 的 3 d 组停止刺激后，引起的胞外钙内流的作用，但是从实验数据显示 NIF 并不能完全抑制胞内钙的变化。Line Scanning of 3-day HFS160 140 120 100 80 60Without-NIF2M-NIF40 20 0图 7：线扫描显示，3 d HFS停止后，Without-NIF胞内 Ca2+荧光强度迅速上升；2M-NIF 细胞内 Ca2+荧光强度变化幅度不明显；：3 d HFS停止时
7、间点 14.4ms。Fig 7：With terminating 3-day HFS，Without-NIF intracellular Ca2+ fluorescence increasedrapidly；2M-NIF intracellular Ca2+ fluorescence did not weaken significantly； period was terminated 14.4ms.24：3-day HFSIntensityIncreased of Fluorescence Intensity %Field Scanning of 3-day HFS127 124 121 1
8、18 115 112 109Without-NIF2M-NIF106 103 100图 8：面扫描显示，3 d HFS停止后，Without-NIF胞内 Ca2+荧光迅速上升；2M-NIF细胞内Ca2+荧光强度变化幅度不明显；：3 d HFS停止时间点 21s。Fig 8：With terminating 3-day HFS，Without-NIF intracellular Ca2+ fluorescence increasedrapidly；2M-NIF intracellular Ca2+ fluorescence did not weaken significantly； period
9、 was terminated 21s.The Effect of NIF on Intracellular Ca2+ in PC12 Cells after Terminating 3-day HFS80 70 60：3-day HFS50 40 30 20 10 0*Without-NIF2M-NIF3-day HFS Line Scanning 3-day HFS Field ScanningScanning Method图 9：3 d HFS停止后，Without-NIF胞内 Ca2+荧光强度迅速上升，线扫描和面扫描上升幅度 分别为 60 %和 3.5 %；2M-NIF组即刻 HFS后
10、胞内 Ca2+荧光强度变化不明显，分别仅为 17.2%和 0.2 %Fig 9：With terminating 3-day HFS，Without-NIF intracellular Ca2+ fluorescence increased rapidlyat respective ranges of 60 % and 3.5 % through both line and field scanning；2M-NIFintracellular fluorescence did not weaken significantly, with respective ranges of only 17
11、.2 % and0.2%*P0.05），仅可检测到较少含量的 cPKC 及 P-PKC，与 Control 组含量接近（图 1、2、3、4）。图 1：HFS后对 PC12细胞内 cPKC含量的影响，Western Blot。 Fig 1：Effect of HFS on amount of cPKC in PC12 cells, Western Blot.32Ratio of cPKC/-actin(%)上海交通大学基础医学院硕士学位论文（2008）第三部分1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0* #ControlHFSHFS+NIF图
12、2：HFS后 PC12细胞内 cPKC的表达 Fig 2：Experssion of cPKC in PC12 cells after HFS *P0.01 vs the Control group # P0.01 vs the HFS+NIF group图 3：HFS后对 PC12细胞内 P-PKC含量的影响，Western Blot。 Fig 3：Effect of HFS on amount of P-PKC in PC12 cells, Western Blot.33Ratio of P-PKC/-actin(%)上海交通大学基础医学院硕士学位论文（2008）1.61.41.210.8
13、0.60.40.20* #第三部分ControlHFSHFS+NIF图 4：HFS后 PC12细胞内 P-PKC的表达 Fig 4：Experssion of P-PKC in PC12 cells after HFS *P0.01 vs the Control group # P0.01 vs the HFS+NIF group3、讨论PD被列为第二大神经退行性疾病，以静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射障碍等临床特征严重影响患者生活质量。造成PD的原因十分复杂，包括氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、线粒体功能障碍、细胞炎症和凋亡以及蛋白质酶学活性的生物学功能障碍等，是多个致病基因、多种致病因子
14、(环境因素)和多条致病途径之间错综复杂交互作用的结果。但什么因素起关键作用，什么因素是继发环节仍然不得而知。调控细胞蛋白质酶学活性的重要物质PKC在PD的发病过程中起重要作用。迄今为止所发现的PKC分类中，cPKC是PKC家族中的一种亚型，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶范畴，同时能被Ca2+激活，从而通过其自身磷酸化调节细胞代谢，分化增殖等8,9。最近已有实验证明PKC家族中的亚型结构是一个氧化应激敏感的激酶，在PD模型细胞的凋亡中起关键调节作用10。对于PD的治疗方式也多种多样。包括药物治疗的标准方法左旋多巴的应用，单34上海交通大学基础医学院硕士学位论文（2008）第三部分侧苍白球(unila
15、teral pallidotomy)毁损术(ablation surgery)和底丘脑核团（subthalamicnucleus，STN）的DBS等。尤其是DBS已经被认为是治疗PD患者的标准方法11。然而通过高频电流刺激治疗PD的机制至今无法给出一个令人信服的解释12。以往通常认为HFS导致细胞质膜电位差，通过对去极化抑制神经元的活性13,14,15。最近Garcia16等人提出高频电流刺激治疗PD存在双重效应，抑制病理性神经元的同时对神经细胞给予新的节律性定向刺激。大量的研究一直试图尽快找到HFS能治疗PD的根本原因。PKC作为细胞信号转导通路中心分子之一，通过对酶蛋白等蛋白质的磷酸化调节
16、自身的活性。cPKC属于PKC的亚型，存在于神经组织中，对Ca2+敏感，可以被Ca2+激活，通过其自身磷酸化调节神经细胞代谢。我们的研究基于细胞分子水平，通过建立经NGF诱导分化PC12为类交感神经细胞体外PD细胞模型，采用与临床治疗PD接近的电流刺激参数17,18，检测电流刺激结束后细胞内cPKC及P-PKC的表达。结果发现经HFS处理后，PC12类神经细胞内的cPKC含量明显增加，但这不能说明cPKC可以被HFS激活，通过检测其自身P-PKC的表达发现，其P-PKC水平同样有显著升高，可见HFS激活细胞内cPKC。以往实验已证明HFS能够改变细胞单钙通道19。本实验的前期实验也证实HFS导致细胞内Ca2+升高。为了进一步探讨HFS是通过何种途径引起PC12类神经细胞内cPKC及P-PKC的表达增加，我们选用L型电压敏感钙通道阻滞剂NIF阻断细胞质膜上部分Ca2+通道，结果发现经NIF处理后，细胞内cPKC及P-PKC的表达均无明显增加。这一结果与以往研究一致，cPKC活性呈Ca2+依赖性
