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1、中国现代应用药学杂志 2009 年 10 月第 26 卷第 10 期 Chin JMAP, 2009 October Vol. 26 No. 10 805 综 述 药用植物次生代谢相关酶基因克隆方法综述 战晴晴1,2，隋春2，张杰1*，魏建和2 (1.东北林业大学生命科学院，哈尔滨 150040；2.中国医学科学院 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China) ABS
2、TRACT: OBJECTIVE Reviewing gene cloning methods and strategies that can be used in medicinal plant secondary metabolism, to provide selection references. METHODS Searching and summarizing literatures on gene cloning of plants, especially of medicinal plants. RESULTS Gene cloning methods used in medi
3、cinal plant secondary metabolism, such as functional cloning method, phenotype cloning methods, transposon tagging and map-based cloning method were elaborated. CONCLUSION There are many methods used to clone genes in medicinal plant secondary metabolism, researchers should choose the suitable one w
4、ith different basis, purposes and experiment condition. KEY WORDS: medicinal plants; secondary metabolism; gene cloning 次生代谢是存在于植物、动物和微生物中有别 于初生代谢的一类特殊而又复杂的代谢类型。通常 认为次生代谢是生物通过渐变或突变获得的一种 适应生存的方式；是生物体在长期进化中对生态环 境适应的结果。植物次生代谢物不仅为人类提供了 丰富的药物，香料及工业原料，而且一些次生代谢 产物还是生物体自身抗性、 信号传导、 适应性调节、 生长发育以及植物花色香味等所需要的。随
5、着分子 生物学及生理生化等学科的发展，关于次生代谢的 研究也越来越深入。鉴于青篙素、紫杉醇及长春新 碱等药用植物有效成分的突出疗效，更显示出了药 用植物次生代谢研究的重要性。药用植物次生代谢 产物种类繁多，结构各异。次生代谢途径也是多样 而复杂的，许多途径目前仍不清楚，只有个别的主 要是青篙素、紫杉醇等代谢物的合成途径取得了一 定研究进展，但也仅仅是了解了合成途径的大致路线1。克隆相关酶基因是药用植物次生代谢研究的 重要内容。 分子生物学发展至今，用于植物基因克隆的方 法有很多种。主要可分为三类： 一种类型是功能克隆，即根据已知基因产物 推断出其相应核苷酸序列，再以此为基础从 cDNA文库或基
6、因组文库中调取目的基因；第二 种类型是表型克隆，是近年来发展十分迅速的一 类方法，例如mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)、 抑制性差减杂交(SSH)、EST文库筛选技术等；第 三类是无基因序列及表达功能信息，但具有转座 子标签或基因遗传图谱等条件，常用转座子标签 法克隆和图位克隆技术。下面主要针对三类基因 克隆方法的基本原理及在药用植物次生代谢研究 中的应用情况进行综述，为药用植物次生代谢酶 基因的克隆研究提供借鉴。 基金项目：国家科技支撑计划重点项目（2006BAI09B01） ；博士后科学基金资助（20070410615） ；中央级院所长科研基金项目（YZ-1-10）作者简介：战晴晴
7、，女，硕士 Tel: (010)62895272 E-mail： *通信作者：张杰，博士，副教授 Tel: (0451)82911322 E-mail： 806 Chin JMAP, 2009 October Vol. 26 No. 10 中国现代应用药学杂志 2009 年 10 月第 26 卷第 10 期1 功能克隆方法 这类方法的主要步骤是首先通过生物化学等 研究手段分离纯化出有关基因编码的蛋白产物，然 后测定蛋白质氨基酸序列，推断出编码该蛋白质的 部分基因序列，再通过抗体、寡聚核苷酸探针或 PCR制备的探针杂交筛选基因组或cDNA文库最终 克隆到目的基因。功能克隆是一种经典的基因克隆 策
8、略，关键是能够分离出纯度很高的单一蛋白质。 很多基因尤其是没有任何核酸序列可利用的基因 在首次克隆时常采用这种方法达到目的。 Inoue等2利用这一方法克隆了闭鞘姜(Costus speciosus)呋甾烷26-O-葡糖苷酶基因。首先从闭 鞘姜根茎提取酶蛋白，利用HPLC洗脱收集单一峰 蛋白。纯化的蛋白用内肽酶Lys-C消化，消化后的 肽段经C18柱分离，然后针对收集的不同肽段进行 氨基酸序列分析。最后利用从氨基酸序列推测的核 酸序列设计引物，结合巢式PCR和RACE方法得 到多条片段，拼接成全长cDNA序列。Grothe等3 从罂粟(Papazer somniferum)悬浮培养细胞系中纯化
9、 出Salutaridinol 乙酰转移酶，然后经电泳、蛋白酶 消化、肽段分离及序列测定程序，再根据氨基酸序 列推测核酸序列，设计引物，RT-PCR获得部分片 段后，同样经RACE获得全长序列。 采用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因， 但由于绝大多数基因的产物目前还不知道。所以大 多数基因难以用这一经典的方法来克隆。尤其是对 于药用植物次生代谢途径中的酶类，含量低且常常 处于不稳定状态，所以更难以分离纯化。但当其它 植物的同类基因已克隆到并且其核苷酸序列保守性 较高时， 一方面可设计简并引物，PCR扩增得到目标 植物中的目的基因片段，制备探针后杂交筛选目标 植物基因组或cDNA文库，也可进一
10、步利用RACE方 法，克隆到未知新基因；另一方面也可直接利用其 它植物同类基因序列制备探针在控制杂交条件下筛 选目标植物基因组或cDNA文库。Wallaart等4利用这 类方法首先比对其它植物中相关基因序列后在保守 区设计简并引物，然后将RT-PCR扩增产物作为探针 与青蒿的一个cDNA文库进行杂交， 从中筛选得到了 青蒿素合成途径中的倍半萜环化酶即amorpha-4, 11-diene合酶的全长cDNA。进而开展了后续的基因 功能研究。Hotze等5也是利用这种方法克隆到了长 春花苯丙酸途径中的肉桂酸-4-羟化酶cDNA。肉桂 酸-4-羟化酶是参与黄酮类化合物形成的一种P450 酶类。Hay
11、ashi等6是利用异源植物光果甘草 (Glycyrrhiza glabra)相关基因序列制备了探针， 在低严谨度杂交条件下，筛选目标植物丝瓜的cDNA文 库得到isomultiflorenol合成酶(丝瓜中形成拜俄尼酸 的一种三萜合成酶)cDNA序列。 随着药用植物次生代谢酶基因获得数目的不 断增长，会有更多不同植物种类中的相关基因通过 这一方法得到克隆。比较这些同源基因的相似相异 点及进行深入的功能分析，将为全面阐明重要药用 植物的代谢途径和调控机理奠定基础。 2 表型克隆方法 药用植物次生代谢产物种类繁多、结构迥异， 产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育 时期的特异性。研究表明一些
12、诱导物如茉莉酸甲酯 等的刺激也会导致药用植物次生代谢产物含量增 加，代谢产物增长是代谢途径酶基因表达增加，酶 活性增强的结果。目前一些药用植物种类已建立了 细胞及组织器官离体培养体系，更便于次生代谢途 径及调控机理的研究。其中一些次生代谢相关酶基 因的克隆就是以代谢产物含量存在明显差异的材 料为基础，利用表型差异克隆技术实现的。这类方 法中有很多相类似的技术手段，包括差异显示技术 (DD-PCR)7、cDNA-AFLP法8、 差减扣除杂交(SSH) 法9及微阵列杂交(microarry)10等。这些方法不仅 可用来克隆基因，同时也是研究基因表达特性的重 要手段。 2.1 差异显示技术 1992
13、年，Liang和Pardee7首次提出差异显示 技术(mRNA Differential Display PCR, DD-PCR)，该 技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRNA 的优点，成为克隆新基因和研究植物基因表达的有 力工具。 差异显示技术方法是： 利用一系列oligo (dT) 引物， 以不同处理植物的总mRNA为模板进行反转 录得到cDNA，再用此引物和5端随机引物对反转 录产物进行PCR扩增， 并利用变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳，从中筛选出差异片段；回收差异片段后再进 行第二次PCR，以扩增出的差异片段为探针进行 Northern杂交，去掉假阳性片段并对目的片段进行 测序；最后以
14、克隆的目的片段为探针，从基因组文 库中筛选出相应的全长基因。通常在获得目的基因 片段基础上，也可采用5及3RACE的方法获得目 的基因全序列。 Schoendorf等11利用差异显示RT-PCR方法获 得了13个相关的P450 cDNA全序列，随后在酵母体 系中通过原位分光光度法和添加紫杉烷底物后测 定体内氧化酶活性的方法进行了功能分析。首次克 隆了紫杉醇生物合成途径中的P450基因。Cao等12中国现代应用药学杂志 2009 年 10 月第 26 卷第 10 期 Chin JMAP, 2009 October Vol. 26 No. 10 807也利用mRNA差异显示PCR和RACE方法结合
15、获得 了甘蓝(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino, syn. B. rapa L.)中的一个P450基因。 DD-PCR技术以其快速、灵敏、操作简单，不 仅可以大规模地了解已知基因转录的差异，还可以 发现新的基因片段等优点受到了药用植物基因克 隆工作者的青睐。虽然它本身还有一些的局限性如 假阳性高、得到的cDNA 片段也比较短, 但近年来 随着对技术环节的不断改进，mRNA差异显示技术 将深入到了有关基因差异表达研究的各个领域。 2.2 cDNA-AFLP法 1996年，Bachem 8将DD-PCR法与AFLP(Amplified fragment length polymor-phism)结合，探索马铃薯块茎 发育情况，并克隆了2个cDNA片段 (TDF536和 TDF531)。其方法步骤是：mRNA反转录形成cDNA 双链，再用两种限制性内切酶消化，一种是常用内切 酶EcoRI，一种是稀有内切酶MseI。然后在消化的 cDNA片段上连上接头，再利用与接头相配对的引物 进行预扩增。预扩增后，用有2个或3个选择性碱基的 引物进行PCR扩增，扩增产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离差异片段。 与DD-PCR技术相比而言cDNA-AFLP 技术更适合对转录组进行全面的分析13 ，结果假阳
