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1、pp蛋白质免疫印迹技术及蛋白质免疫印迹技术及pp常见问题分析常见问题分析张绍进Western BlotqqWestern BlotWestern Blot简介简介qqWestern BlotWestern Blot一般流程一般流程qqWestern BlotWestern Blot常见问题分析常见问题分析Western BlotWestern Blot 简介：p印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。p1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Sout
2、hern印迹法。p而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。Western BlotWestern Blot Western Blot 基本原理基本原理Western BlotWestern Blot Western Blot 优点优点p 高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原-抗体反应p 1-5ng中等大小的靶蛋白Western BlotWestern BlotWestern Blot应用应用q目的蛋白的表达特性分析q目的
3、蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析Western BlotWestern Blot Western Blot 流程流程l蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色Western Blot?通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂最常用的溶剂 。有机溶剂提取法有机溶剂提取法对于分子中非极性
4、侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。包括乙醇、丙酮和丁醇等。?通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的提取Western Blot蛋白样品的定量蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：BradfordBradford法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、LowryLowry法（法（FolinFolin- -酚试剂法酚试剂法）、）、 BCABCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定
5、量试剂盒操作说明体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。操作，测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总：蛋白质浓度测定的各种方法汇总：http:/ Blot蛋白样品的变性蛋白样品的变性p2SDS-PAGE上样缓冲液：pDTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。p按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min， 冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量20 50g。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油20 ml 溴酚蓝蓝0.2 g 总总体积积100ml 100mM Tris-HC
6、l(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰 20%甘油 ddH2OWestern BlotSDS：p阴离子去污剂 变性剂p氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。p蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。p与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线 性化。Western Blot蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比
7、Western Blotq不连续的电泳缓冲体系。qSDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Western BlotpSDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDSSDS是一种很强的阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三 级结构。p强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形 成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷 的蛋白质-SDS复合物。p
8、蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。【SDS-PAGESDS-PAGE基本原理基本原理】Western Blot凝胶成分M丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMEDM过硫酸铵MTris-甘氨酸电泳缓冲液Western BlotPAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N-亚甲基双丙
9、烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。Western Blot聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： 单体：丙烯酰胺（Acr）； 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； 产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光
10、化学催化（核黄素TMTED）体系。Western Blot凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方 表：http:/ Western Blot不连续电泳：作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris- Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris- Cl高，根据蛋 白大小电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。Western Blot灌制分离胶 隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%Western Bl
11、ot灌制积层胶 插入梳子 Western BlotStaking gelSeparating gelWestern Blot转膜p要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固 相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法： 毛细管印迹法和电泳印迹法。p常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者 的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。 Western Blot转移膜的选择转移膜的选择p最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸 纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟 乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜 ，此外也有用尼龙膜、
12、DEAE纤维素膜做蛋 白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用 于核酸杂交。p各种膜的详细特点介绍：phttp:/ Blot湿转系统Western Blot半干转移系统Western Blot 丽春红染色丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 转膜后检测（此步可以省略）转膜后检测（此步可以省略）Western Blot封闭封闭S S为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，发生非特异性结合，使非特异
13、性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。S S5%5%脱脂奶粉或脱脂奶粉或BSABSA（室温孵育（室温孵育1h1h）S SWestern Blot Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）膜封闭液（生物试剂公司）S STween-20Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。响抗体与抗原的结合。Western Blot一抗、二抗孵育p把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。p回收一抗溶液，用TBST
14、漂洗膜3次，每次10min。p加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 p回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。p最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。Western Blot二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP)Western Blot膜解吸方法（膜的重复利用） p通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离， 适用于任何化学发光底物系统。p酸解吸原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位 点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任 何化学发光底物系统。Western
15、 BlotWestern Blot结果分析p目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校 正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白 相对含量。pWestern Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程） http:/ Western BlotWestern BlotWestern Blot常见问题分析常见问题分析Western BlotSDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳uu胶不平？胶不平？uu凝胶漏液？凝胶漏液？胶板洗刷干净胶板洗刷干净加入加入APAP和和TEMEDTEMED的量要合适的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀均匀两块玻璃板底部要对齐两块玻璃板底部要对齐Western Blotuu条带比正常的窄？条带比正常的窄？uu“微笑微笑”或或“倒微笑倒微笑”条带？条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓均
