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1、to 10%EG+10%DMSO for 1min , 3min, 5min and to EDFS40 for 30sand 1min by two-step method, the morphologicaly normal rates were70.22%, 61.28%, 49.68%, 59.66%, 51.00% and 39.27% respectively, thecleavage rates were 59.84%, 51.24%, 42.70%, 51.04%, 44.04% and33.30% respectively. There were statistical di
2、fference between treated andcontrol group(91.32%,68.78%, P0.05) 猪卵母细胞体外孤雌发育率在 58h 组为最高但与 70h 组无显著差异(P0.05) 46h培养组的孤雌发育率明显低于其他两组 差异性显著 P0.05) 46h培养组孤雌发育形成的囊胚与 58h 70h组间的差异显著(P0.05)表 2-2 成熟时间及孤雌发育对囊胚发育的影响26Table 2-2 The effect of maturation time and parthenogenesison the blastocyst development成熟时间体外受精
3、卵裂数囊胚率% Maturation time46h58h70hIVF+-+-+-No. of oocytes cleavage151112196164157150The blastocyst rate(%)25 (16.50) a9 (8.05) b16 (8.17) b8 (4.82) cd10 (6.26) bc5 (3.16) d注+表示受精-表示孤雌发育同一列数据上角标注字母不同者示 P0.05Note:+show IVF,-show parthenogenesisValues with different superscripts with the same parameter w
4、as significantly different(P0.05)讨论讨论1 体外培养时间对体外受精的影响体外培养时间对体外受精的影响由于培养方法确定标准 卵母细胞的选择以及实验者的不同确定的体外成熟时间差异很大谭世俭等127证明牛卵母细胞的体外成熟培养时间对体外受精的效果具有重要影响 因为哺乳动物卵的核成熟过程即使在简单的培养条件下也能自发地进行但能否获得正常的受精卵裂及随后的胚胎发育能力则主要与细胞质的同步成熟有关一般在核成熟研究中M 染色体体外成熟和受精的时间一般在 36h 以内而在研究受精能力原核形成与发育能力的基础上确定 IVM 时间多选择在 4448h 之间99由于卵母细胞在成熟过
5、程中细胞核及胞质的成熟并不是同步完成的吴光明126研究证明猪卵母细胞体外成熟36h 后,核成熟率达到高峰但此时细胞质成熟仍在继续而体外成熟培养 48h后超微结构显示卵母细胞此时才完成与体内过程基本相同的成熟过程由此证明了体外培养猪卵母细胞的核成熟后也需要一段时间才完成胞质成熟128本研究结果证明猪卵母细胞体外成熟培养 46h 的卵裂率和囊胚发育率显著高于 58h和 70h 组这与猪卵母细胞体内成熟在 LH 高峰或注射 hCG 后 42 48h 最适于 IVF 的结论一致27Yamamo 等129在仓鼠的实验中证实性周期开始 36h 交配体内受精后的卵裂率明显降低 小鼠排卵后输卵管内卵子停留时间
6、延长导致体外受精后的卵裂率随着卵龄的延长受精率降低130中原等131也证明了牛体外培养时间的延长卵裂率降低 实验表明成熟培养时间对成熟度具有明显作用培养时间过短过长都影响卵母细胞的受精以及其后的胚胎发育132培养时间过短卵母细胞不能完成成熟影响其后受精率 而培养时间过长卵母细胞的成熟率显著上升同时卵母细胞过度成熟老化,一方面可能导致卵母细胞对受精过程不敏感另一方面,过长时间培养也可能导致卵母细胞的失活或活力下降,从而引起受精率的降低 朱淑文等133证明了随体外培养时间的延长牛卵母细胞的卵裂率降低并导致染色体异常发生率增加本研究证明猪卵母细胞体外培养时间的延长虽然卵裂率升高但从胚胎发育能力看58
7、h 和 70h 体外成熟的卵母细胞受精后囊胚形成率下降这与其他有关报道基本一致1332 体外成熟时间对孤雌发育的影响体外成熟时间对孤雌发育的影响高野等134证明随着体外成熟培养时间的延长牛卵母细胞的孤雌发生率升高但囊胚的发生率降低 135在鼠53仓鼠129兔 54和牛56的研究中均发现随卵龄增加激活率上升本研究表明随着培养时间的延长孤雌发育明显增加但孤雌发育所产生的胚胎发育能力很低这可能是由于卵龄长的猪卵母细胞在激活条件下更易于诱导卵细胞质中游离的 Ca2+增加,破坏成熟卵母细胞所维系的M 期卵的平衡,导致成熟促进因子 MPF 水平降低,启动卵母细胞活化,在适宜的体外培养条件下发生卵裂 136
8、每一次卵裂所形成卵裂球都将决定胚胎完成个体发育的命运,由于细胞数是在卵裂过程中形成的由母型 mRNA 调控其分布的一个极其协调的过程,孤雌活化缺乏由母型调控向合子型调控胚胎发育的过程,更重要的是缺乏雄性所携带的那半基因组,由于 Ca2+浓度的变化激活了卵胞质内蛋白质和 DNA 的合成,蛋白质的合成主要利用储备在胞质中的母源 mRNA,包括组蛋白微管蛋白肌动蛋白和早期发育所需的形态生成因子等,来维系像受精卵一样所要完成的胚胎发育过程显然是一种天然缺陷 , 董雅娟等137也证明了这可能是造成孤雌活化囊胚细胞数少的重要因素之一,由于细胞数是影响胚胎着床器官形成的重要因素,这一点可能是到目前为止尚未获
9、得孤雌活化动物的一个主要因素这与本实验中孤雌发育所产生的胚胎后期发育能力低的结果相一致28卵龄和激活的关系目前尚不清楚 有待于进一步的研究原因可能是卵母细胞停滞在 M 时期是以高水平的促成熟因子MPF 活性来维持的利用组蛋白 H1 激酶活性测定 MPF 活性发现牛卵母细胞成熟后 2441h 的 MPF 活性基本相似138可见卵龄增加引起激活率上升并不一定是因为 MPF 活性下降MPF 失活是由于 P34cdc2 磷酸化,细胞周期蛋白降解引起另外受精时的 Ca2+短暂释放也是中止减数分裂开始细胞周期蛋白降解的反应可能由于老龄卵母细胞在细胞周期蛋白降解过程中对于细胞内 Ca2+释放更为敏感139卵
10、母细胞随着卵龄的增加活化能力增强Web 等140也认为随着卵龄的延长和卵母细胞质的老化,维持减数分裂阻滞的物质的降解,卵母细胞易被激活猪卵母细胞体外培养中孤雌发育对于研究卵母细胞的激活创造有利条件卵母细胞的激活是细胞核移植的关键环节 激活和孤雌发育与核移植成功密切相关猪卵母细胞核移植时作为核受体的卵母细胞对移入核的基因重排及重组胚胎的发育具有决定作用老龄卵母细胞作为受体胞质时阻止早熟染色体凝集和以后的核膨胀故发育率较低141邹贤刚(1993)等 139也较为系统地研究了卵龄对兔核移植效率的影响认为随卵龄的增加卵母细胞的染色体逐渐远离极体进而影响去核率在牛上的研究中也发现老龄卵母细胞作核受体时移
11、入核不发生核膜破裂而用非老化卵母细胞作核受体时 则能够发生核膜破裂142可见老龄卵母细胞内重排移入核或支持进一步发育的胞质成分可能已经发生退化不宜用作核受体因为移核后的卵母细胞的核物质被胚胎细胞核所代替移入的核物质的复制等过程完全依赖于卵母细胞的激活因此核移植时要选择合适卵龄的卵母细胞作受体29第二节第二节 冷冻保护剂对猪卵母细胞的毒性实验冷冻保护剂对猪卵母细胞的毒性实验引言引言1985 年 Rall 和 Fally 首次发明了玻璃化冷冻法用于小鼠胚胎冷冻保存 并获得成功随后人们将此方法应用于各种动物的胚胎和卵母细胞的冷冻研究由于卵母细胞对高渗处理液比较敏感,玻璃化冷冻时卵母细胞需要一定的平衡
12、处理冷冻前的平衡处理和解冻后的恢复处理均会产生很大的渗透压变化 浸于冷冻保护剂中的卵母细胞又易被高浓度冷冻保护剂的毒性所伤这是玻璃化成功的最大障碍为将毒性损伤减少到最低限度一方面要选择低毒的冷冻保护剂另一方面需严格控制细胞与高浓度冷冻保护剂溶液接触的时间加快降温和复温速率本研究对用一步法和二步法对玻璃化冷冻前的平衡和脱除冷冻保护剂后的恢复处理对猪卵母细胞质量的影响程度目的在于探讨冻前处理时卵母细胞与玻璃化溶液接触的方法和时间对其的化学毒性作用选择合适的平衡方法和平衡时间为进一步提高猪卵母细胞冷冻保护效果提供理论基础和技术途径为玻璃化冷冻的成功做准备30材料方法与实验设计材料方法与实验设计1 材
13、料方法材料方法1.1 材料材料1.1.1 DMSO: Sigma D-26501.1.2 EG: Sigma 29323-71.1.3 Sucrose: Sigma S-93781.1.4 Ficoll: Sigma F-28781.1.5 细胞松弛素 B Sigma C-67621.1.6 其余所用材料与本章第一节相同1.2 方法方法1.2.1 液体的配制液体的配制1.2.1.1 玻璃化溶液玻璃化溶液基础液为 TCM-199+3mg/ml BSA玻璃化溶液基础液+10% EG +10% DMSO玻璃化溶液300g/L 聚蔗糖Ficoll 70000 添加 0.5mol/L 蔗糖经基础液溶解后
14、制成 FS 溶液 FS 液与玻璃化溶液以 6:4v:v 比例配制成 EDFS40 玻璃化溶液1.2.1.2 解冻液解冻液用基础液稀释而成的含 0.5mol/L蔗糖的 TCM-199 溶液1.2.2 猪卵母细胞的体外成熟培养猪卵母细胞的体外成熟培养方法同本章第一节1.2.3 卵母细胞的处理卵母细胞的处理将室温调至 25 27玻璃化溶液及解冻液先在培养箱中预热 15min 后待用试验在 3839恒温台上操作卵母细胞成熟培养 46h 后 在基础液中用吸管反复吹打去除多余卵丘使卵母细胞周围留下 12 层卵丘细胞然后移入含 7.5g/ml 细胞松弛素 B 的基础液中孵育 10 分钟1.2.4 玻璃化液的
15、处理玻璃化液的处理将细胞松弛素 B 处理后的卵母细胞3 1移入玻璃化溶液和 EDFS40 平衡一定时间1.2.5 玻璃化液的除去玻璃化液的除去将平衡处理后的卵母细胞移入含 0.5M 蔗糖的 TCM-199 溶液和基础液中在室温下各平衡 5 min 以脱出卵母细胞内的冷冻保护剂然后移入已平衡好的NCSU-37 成熟培养液中洗 23 次5% CO239饱和湿度条件下培养 2h1.2.4 卵母细胞形态正常率的判定卵母细胞形态正常率的判定在实体显微镜下检查卵母细胞形态是否正常以卵母细胞质中含均匀分布颗粒卵周隙清晰可辨透明带完整的为正常卵1432 实验设计实验设计2.1 EDFS40 一步法对卵母细胞化
16、学毒性试验一步法对卵母细胞化学毒性试验分别将卵母细胞放入 EDFS40 中平衡 30s 1min脱除玻璃化液后计算形态正常率 随后受精设体外成熟的新鲜卵母细胞体外受精为对照组 体外受精方法及卵裂率观察同本章第一节2.2 EDFS40 二步法对卵母细胞化学毒性试验二步法对卵母细胞化学毒性试验分别将卵母细胞用 10%EG+10%DMSO 内处理 1min 3min5min再移入EDFS40 中处理 30s 和 1min 后在 0.5 M蔗糖溶液中脱除玻璃化液后计算形态正常率随后体外受精 观察卵裂率设新鲜卵母细胞体外受精为对照组体外受精方法及卵裂率观察同本章第一节3 结果统计分析结果统计分析每组实验重复 5 次所得数据采用 SAS 统计软件32进行显著性检验结果结果1 EDFS40 一步法对卵母细胞化学毒性试验一步法对卵母细胞化学毒性试验结果见表 2-3各处理组的卵母细胞形态正常率与对照组之间差异显著P0.05随着处理时间的延长体外受精后的卵裂率下降 不同处理组与对照组之间有明显差异P
