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1、1 第 10 章 DNA 的生物合成 复制(replication) 是指遗传物质的传代， 以母链 DNA 为模板合成子链 DNA 的过程。 第 一 节 复制的基本规律 复制的基本规律 复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication) 一、半保留复制是 DNA 复制的基本特征 复制的方式 半保留复制 (semi-conservative replication) 定义：DNA 生物合成时，母链 DNA 解开为两股单链，
2、各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的 DNA，一股单链从亲代完整地接受过来， 另一股单链则完全从新合成。 两个子细胞的 DNA 都和亲代 DNA 碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。 半保留复制的意义: 按半保留复制方式， 子代 DNA 与亲代 DNA 的碱基序列一致， 即子代保留了亲代的全部遗传信息， 体现了遗传的保守性。 遗传的保守性， 是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。 二、DNA 复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制 双向复制(bidirectional replication) 原核生物复制时，DNA 从起始点(origin)向
3、两个方向解链， 形成两个延伸方向相反的复制叉， 称为双向复制。 真核生物每个染色体有多个起始点， 是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。 三、 DNA 一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制 半不连续复制(semi-discontinuous replication) 顺着解链方向生成的子链， 复制是连续进行的， 这股链称为领头链(leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反， 不能顺着解链方向连续延长， 这股不连续复制的链称为随从链(lagging strand) 。复制
4、中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制， 就是复制的半不连续性。 第 二 节 DNA 复制的酶学和拓扑学变化 参与 DNA 复制的物质: 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶(polymerase): 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶，简写为 DNA-pol； 模板(template): 解开成单链的 DNA 母链； 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合； 其他的酶和蛋白质因子。 一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应 聚合反应的特点: DNA
5、 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿 5 3方向进行。 二、DNA 聚合酶催化核苷酸之间聚合 全称： 依赖 DNA 的 DNA 聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol 活性： 1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性 3 5外切酶活性: 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5 3外切酶活性: 能切除突变的 DNA 片段。 （一）原核生物的 DNA 聚合酶分为三型 DNA-pol 功能： 对复制中的错误进行校读， 对复制和修复中出现的空隙进行填补。 木瓜蛋白酶水解： 1. 小片段，323 个氨基酸 ， 5 核酸外切酶活性 2. 大片段/
6、Klenow 片段，604 个氨基酸 ，DNA聚合酶活性 ， 5 核酸外切酶活性 3. Klenow 片段是实验室合成 DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol DNA-pol II 基因发生突变，细菌依然能存活。 2 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的 DNA 模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与 DNA 损伤的应急状态修复。 DNA-pol 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 （二）常见的真核细胞 DNA 聚合酶有五种 DNA-pol ：起始引发，有引物酶活性。 DNA-pol ：参与低保真度的复制 。 DNA-pol ：在线粒体 DN
7、A 复制中起催化作用。 DNA-pol ：延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 DNA-pol ：在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。 三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行， 是遗传信息能准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。 （一）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正 核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。 例： A：DNA-pol 的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol 不表现活性。
8、 （二）复制的保真性依赖正确的碱基选择 DNA 聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型， 与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 DNA 复制的保真性至少要依赖三种机制： 遵守严格的碱基配对规律； 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 复制出错时 DNA-pol 的及时校读功能。 四、复制中的分子解链伴有 DNA 分子拓扑学变化 DNA 分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA 解成单链，它才能起模板作用。 （一）多种酶参与 DNA 解链和稳定单链状态 解螺旋酶(helicase)利用 ATP 供能，作用于氢键，使
9、DNA 双链解开成为两条单链。 引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶。 单链 DNA 结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。 （二） DNA 拓扑异构酶改变 DNA 超螺旋状态、 理顺 DNA链 拓扑异构酶作用特点： 既能水解 、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶分类 拓扑异构酶 作用机制：切断 DNA 双链中一股链，使 DNA 解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA 变为松弛状态。反应不需 ATP。 拓扑异构酶 作用机制：切断 DNA 分子两股链，断端通过切口旋转使超
10、螺旋松弛。 利用 ATP 供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。 五、DNA 连接酶连接 DNA 双链中的单链缺口 3 DNA 连接酶(DNA ligase)作用方式： 连接 DNA 链 3-OH 末端和相邻 DNA 链 5-P 末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的 DNA链连接成一条完整的链。 功能： DNA 连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在 DNA 修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。 第 三 节 DNA 生物合成过程 一、原核生物的 DNA 生物合成 （一）复制起始：DNA 解链形成引发体 需要解决两个问题： 1. DNA 解开成
11、单链，提供模板。 2. 形成引发体，合成引物，提供 3-OH 末端。 过程： 1. DNA 解链 2. 引发体和引物 含有解螺旋酶、DnaC 蛋白、引物酶和 DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。 引物：是由引物酶催化合成的短链 RNA 分子。 （二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制 复制的延长指在 DNA-pol 催化下，dNTP 以 dNMP 的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 领头链的子链沿着 53方向可以连续地延长。 同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长 （三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口 原核
12、生物基因是环状 DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 二、真核生物的 DNA 生物合成 细胞能否分裂，决定于进入 S 期及 M 期这两个关键点。G1S 及 G2M 的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。 （一）真核生物复制的起始与原核基本相似 真核生物每个染色体有多个起始点， 是多复制子复制。 复制有时序性， 即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要 DNA-pol （引物酶活性） 和 pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原（prol
13、iferation cell nuclear antigen， PCNA） 在复制起始和延长中起关键作用。PCNA 为同源三聚体， 具有与 E.coli DNA 聚合酶的 亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动 DNA 夹子，在 RFC 的作用下 PCNA结合于引物模板链；并且 PCNA 使 pol 获得持续合成能力。PCNA 水平也是检验细胞增殖的重要指标。 细胞能否分裂，决定于进入 S 期及 M 期这两个关键点。G1S 及 G2M 的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。 相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化
14、亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。 哺乳类动物细胞内还发现天然抑制 CDK 的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是 CDK4 的特异性抑制物，P21 蛋白能抑制多种 CDK。锚蛋白和 P21 蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭， 因此被形容为细胞周期的检查点(check point)蛋白。 （二）真核生物复制的延长发生 DNA 聚合酶 / 转换 DNA-pol 和 pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。 在复制叉及引物生成后， DNA-pol 通过 PCNA的协同作用， 逐步取代 pol ， 在 RNA 引物的 3-OH基础上连续合成领
15、头链。随从链引物也由 pol 催化合成。然后由 PCNA 协同，pol 置换 pol ，继续合成 DNA 子链。 （三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题 染色体 DNA 呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 4 染色体两端 DNA 子链上最后复制的 RNA 引物， 去除后留下空隙。 端粒(telomere):指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 端粒的结构特点： 由末端单链 DNA 序列和蛋白质构成。 末端 DNA 序列是多次重复的富含 G、C 碱基的短序列。 端粒的功能： 维持染色体的稳定性 维持 DNA 复制的完整性 端粒酶(telomerase) 端粒酶 RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 第四节 逆转录和其他复制方式 一、逆转录病毒的基因组是 RNA，其复制方式是逆转录 RNA
