《人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的实验研究（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌太学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位敝作者躲，巩吩签字嗍。石年f 月伽学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允询一论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、
2、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：，葫f 嘶签字日期：口6 年6 月f 口日学位论文作者毕业后去向工作单位：通讯地址：导师签名历彳D - - c签字日期：形年月王日电话：邮编：人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的实验研究硕士研究生导师摘周红辉万福生教授要目的本实验旨在探讨人骨髓M S C s ( h M S C s ) 的分离、纯化、体外扩增以及向软骨细胞分化的条件。使用特定的诱导培养基对骨髓问充质干细胞进行诱导培养，用半定量R T P C R 的方法检测其是否表达I I 型胶原，探讨骨髓间充质干细胞在体外向软骨细胞分化的可能性，为
3、M S C s 应用于软骨组织工程，修复损伤的软骨组织提供理论依据和技术支持。方法无菌条件下临床采集无血液系统疾病和家族遗传史的2 8 6 5 岁成人骨髓8例，用含I O F B S 的D M E M 培养液5 倍稀释，2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，弃上清及脂肪层，加入5 m l 含1 0 F B S 的D M E M 培养液，制成细胞悬液。将其接种于间充质干细胞培养液( 低糖D M E M ，含1 0 F B S ，1 0 0 u m l 青霉素，1 0 0 “g m l 链霉素)中，置于3 7 。C 、5 C 0 。饱和湿度的孵箱内培养。3 天后更换培养液，小心弃去未贴
4、壁细胞。以后每3 天换液一次。待细胞长至铺满瓶底8 0 时，用0 2 5 的胰蛋白酶消化传代，再以( 6 8 ) 1 0 3 c m z 的密度接种传代培养：去除培养液，P B S 冲洗1 次，用0 2 5 的胰蛋白酶置3 7 。C 、5 C 0 。饱和湿度的孵箱内消化3 5分钟，见细胞松动浮起时，F B S 终止消化，1 5 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清，加入含1 0 F B S 的D M E M 培养液，调整细胞浓度，接种于2 5 c m a 培养瓶中，3 m l 瓶，置于3 7 、5 C 0 。和饱和湿度的孵箱内培养，每3 天换液1 次。取第取扩增至第3 代的h M S C
5、s 以5 1 0 4 m l 的密度接种于预先放置有消毒处理好的盖玻片的6 孔板内。细胞贴壁后更换培养液。实验分2 组。实验组每孔加入2 m l 无血清低糖D M E M 培养液，内含2 m g L 胰岛素、3 m g L 转铁蛋白、l m m o l L 丙酮酸、1 0 0 n m o l L 地塞米松和1 0ug LT G F p 。对照组每孔加入2 m l 低糖D M E M 基础培养液。每组加3 孔。细胞在3 7 、5 C 0 。和饱和湿度的孵箱内培养，每3 4天换液1 次。分别在诱导后的7 天、1 4 天取出玻片，进行细胞形态学、组织化学分析，与及M S C s 诱导分化的软骨细胞I
6、 I 型胶原m R N A 表达的检测。结果原代培养时细胞接种2 4 小时后即有少量圆形细胞贴壁，4 8 小时后贴壁细胞增多。7 2 小时后已出现数个细胞集落，每个集落约由几个到几十个细胞组成，此时培养液中仍有许多悬浮细胞。经过2 3 次换液后，悬浮细胞多已被去除，贴壁变形的细胞增多，有的细胞已伸长形成长梭形或多角形，呈成纤维样细胞形态，胞浆内有细胞小颗粒，核大、圆形或椭圆形。培养瓶中的细胞集落逐渐增多，增大，1 2 - 1 4 天时集落逐渐相互融合。传代培养后细胞的生长速度明显加快，经历2 4 - 4 8 小时后的缓滞期后迅速进入对数生长期，1 0 一1 5 天铺满瓶底。诱导7 天及1 4
7、天后骨髓M S C s 蕃红花O 染色阳性，而对照组细胞染色阴性。表明经诱导后的骨髓M S C s 有粘多糖的分泌。经半定量R T P C R 检测，诱导7 天和1 4 天的骨髓M S C s 表达C O L 2 A 1m a N A ，对照组未见表达。表明经诱导后的骨髓M S C s 有软骨细胞特异性I I 型胶原m R N A 表达。结论( 1 ) 采用直接贴壁培养法成功分离和培养出骨髓问充质干细胞，该法可成为分离骨髓M S C s 的常规方法。( 2 ) 本实验在单层培养条件下，成功将人骨髓M S C s 诱导分化成软骨细胞。经诱导培养后形成的软骨细胞具有软骨细胞的形态特征，并能分泌软骨
8、细胞的细胞外基质成分粘多糖和特异性I I 型胶原。关键词骨髓问充质干细胞软骨细胞细胞培养分化S t u d yo nd i f f e r e n t i a t i o ni n t oc h o n d r o c y t e so fh u m a nb o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l i si nv i t r oP o s t g r a d u a t eS u p e r v i s o rZ h o uH o n g - H u iW a nF u S h e n gA b s t r a c tA i mT
9、oi s o l a t e ，c u l t u r e ，a n dm u l t i p l ym e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( M S C s ) f r o mh u m a nb o n em a r r o wa s p i r a t i o n ，t h e ni n d u c eM S C sw i t hs p e c i a lc u l t u r em e d i u ma n dd e t e c tt h ee x p r e s s i o no fc o l l a g e nt y p eI Io fc h
10、o n d r o c y t ew i t hs e m i a u a n t i t a t i v eR T P C Ra n a l y s i st oe x p l o r et h ep o s s i b i t yo fi t sd i f f e r e n t i a t i o ni n t oc h o n d r o c y t e si nv i t r o T h a tw i l lg i v ean e ws u p p o r tf o ru s i n go fM S C si nc a r t i l a g ee n g i n e e r i n
11、 ga n dt h e r a p i n gt h ef u n c t i o n a ldis o r d e ro rd e f icie n c yo fc h o n d r o c y t e s M e t h o d s ：B e n em a r r o wa s p i r a t i o ns a m p l e sw e r eo b t a i n e df r o m8a d u l th u m a nd o n o r s2 8t o6 5y e a r so l dw i t h o u ts e v e r eh e m a t o p i e t i
12、ca n dg e n e t i cd i s e a s e s T h e yw e r ed i l u t e dt of i v ef o l d si nc o n v e n t i o n a lc u l t u r em e d i u m( D M E Ms u p p l e m e n t e dw i t h1 0 f e t a lb o v i n es e r u m ) a n dc e n t r i f u g a t e d5m i n u t e sa t2 0 0 0 r p m D is c a r d e dt h es u p e r n
13、a t a n ta n df a tl a y e r ，t h er e m a i n1 a v e ro fs o l u t i o nt h a tc o n t a i n sm o n o n u c l e a rc e l l sw e r es u s p e n d e di n5 m 1c o n v e n t i o n a lc u l t u r em e d i u m T h e nc e l l sd e r i v e df r o ma d u l th u m a nb o n em a r r o ww e r es e e d e dw i t
14、 hac o n c e n t r a t i o no f1 1 0 6 e e l l s m li nD M E Mi n2 5 c m 2c u l t u r ef l a s k C u l t u r e sa r em a i n t a i n e da t3 7 。Ci nah u m i d i f i e da t m o s p h e r ec o n t a i n i n g5 C 0 2 T h em e d i u mw a sc h a n g e df i r s tti m ea f t e r7 2h e u r s ，a n do n c ee
15、v e r y3d a y st h e r e a f t e r W h e nt h ec u l t u r e sr e a c h e dn e a r l y8 0 o fc o n f l u e n c e ，c e l l sw e r et r y p s i n i z e db y0 2 5 t r y p s i n ，c o l l e c t e d ，r e s u s p e n d e d ，a n dp a s s a g e dw i t hac o n c e n t r a t i o no f ( 6 8 ) 1 0 3 c e l l s c
16、m 2i nc o n v e n t i o n a lc u l t u r em e d i u mi na2 5 c m 2c u l t u r ef l a s k T h em e d i aw e r ec h a n g e de v e r y3d a y s T h ep a s s a g e3M S C sw e r es e e d e dw it hac o n c e n t r a t i o no f5Xi 0 4 c e l i s m li n 6h o l e sc u l t u r ep l a t ec o n t a i n i n gc o v e rg l a s s T h ec u l t u r em a d i aw e r ec h a n g e da f t e rc e l la d h e s i o n T h ee x p e r i m e n tw e r ed i v i
