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1、巯基蛋白酶水解人全唾液的效率和影响因素中文摘要目的：探讨三种巯基蛋白酶( 菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶) 在不同盐浓度、p H 值和温度环境中水解人全唾液生物膜的效率。方法：收集非刺激性的人全唾液( w h o l es a l i v a , W S ) ，采用消散因子石英晶体微天平( Q C M D ) 在体外原位、实时和动态监测入非刺激性全唾液在A u 石英晶体芯片形成生物膜，用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶在不同盐浓度、p H 值和温度环境中水解唾液生物膜。采用3 倍频和归一化方法记录频率改变( A F ) 和能量消散因子改变( A D ) 随时间的变化。用分析软件计算膜
2、的质量减小量( A 朋) 和厚度减小量( 厅) 。通过A m 和a h 评价蛋白酶水解唾液生物膜的效果。结果：菠萝蛋白酶在盐浓度0 0 0 1 0 0 1M 时，A m 和A h 无明显变化，高于O 0 1M 时，A m和A h 随着盐浓度的升高而减小。木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶分别在盐浓度为0 0 0 5M 和0 0 5M 时，a m 和a h 最大，水解效率最高，低于或高于该盐浓度，水解效率都降低。随着p H 值的升高，菠萝蛋白酶的A m 和A h 减小，水解效率降低，即p H5 9 p H6 9 p H7 9 ( 尸 p H 6 9 p H 7 9 ( P 0 0 5 ) ；在木瓜蛋白酶的
3、作用中，F 和D 也都随着盐浓度的降低而增加，不同的是其在盐浓度0 0 0 5M最大，之后，F 变小，D 无明显变化( 尸 0 0 5 ) ；在无花果蛋白酶的作用中，F 则是随着盐浓度的增加而增加，在盐浓度O 0 3M 时最大，盐浓度再增加F则减小，D 在盐浓度0 0 0 1 - - 0 0 5M 间无明显变化( P O 0 5 ) ，在盐浓度为O 0 7M 时则明显减小。1 9图4 不同盐浓度菠萝蛋白酶水解唾液生物膜。F 和A D 随时间的变化曲线图5 不同盐浓度木瓜蛋白酶水解唾液生物膜，F 和D 随时间的变化曲线( a ) c = 0 0 0 1 M ；( b ) C = 0 0 0 5
4、M ；( c ) c = 0 0 1 M ；( d ) c = 0 0 3 M ；( e ) c = 0 0 5 M ；( 0 C 一0 0 7 M图6 不同盐浓度无花果蛋白酶水解唾液生物膜，F 和D 随时间的变化曲线( a ) C = o 0 0 1 M 知) c = 00 0 5 M ；( c ) c = o0 I M ；( d ) C = 0 0 3 M ；( e ) C = 0 0 5 M ；( f ) C = 0 0 7 M3 2 蛋白醇水解唾液生物膜后膜的变化参数R D 、m 和在温度为2 5 “ C ，p S 6 9 时，不同浓度磷酸钠盐缓冲液环境下，浓度为0 5V m o l，
5、L 的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶水解唾液生物膜，生物膜的变化参数R D 、卅和 的测量值见表5 、7 、9 ，统计结果见表6 、8 、1 0 。在蛋白酶的作用下，频率增加，膜的质量和厚度均减小。对同一种蛋白酶，不同盐浓度条件下的脚和 的总体均数进单因素方差分析，结果显示其总体均数不等或不全相等( ， 0 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( 尸一0 0 5 ) 。3 3 盐浓度与脚、 的关系圈2 5 “ C ，p H6 9 时，不同浓度磷酸钠盐缓冲液环境下，浓度为0 5t t m o l 几的菠萝蛋白酶、术瓜蛋白酶和无花果蛋白酶水解唾液生
6、物膜，以盐浓度为横坐标，卅、 为纵坐标，绘制柱状关系图见图7 和图8 。图79仰m 肌川舢m 邢嗍川川一鼎00 0 100 0 500 100 300 500 7盐浓度( , o l L )图8 蛋白酶水解唾液生物膜，盐浓度与A h 的关系图帅0i(，如*。_斗gi；学=m；。3 4 各种盐浓度下三种蛋白酶水解效果参数A m 、a h 的统计比较在温度2 5 ，p H6 9 时，各种盐浓度下三种蛋白酶水解效果参数A m 、A h的统计比较见表1 1 、1 2 。对相同盐浓度下，三种蛋白酶作用后膜的参数变化A m和A h 进行单因素方差分析，结果显示其总体均数不等或不全相等( P O 0 5 )
7、 ，反之差异有统计学意义( P ( o 0 5 ) 。表1 2 各种盐浓度下三种蛋白酶水解效果参数办( m ) 的S N K - q 检验注：上标相同者差异无统计学意义( 胗O 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( 尸 p H79 ( P p H7 9 ( P p H6 9 ( P p H 7 9 ( p ( 0 0 5 ) ；无花果蛋白酶作用中频率的上升幅度( H z ) 为p H7 9 p H 6 9 p H5 9 ( ， O 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( 尸 0 0 5 ) 反之差异有统计学意义( P 哪0 5 ) 。4 3p i t 与m 、 的关系圈2 5 “ ( 2 ，磷酸
8、钠盐缓冲液浓度为O0 1 M 时，不同p H 值环境下，浓度为O5 l u n o l几的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶水解唾液生物膜，阻p H 值为横坐标A m 、A h 为纵坐标。绘制柱状关系图见图1 2 和图1 3 。口p f i p a i n6 9舶T阿图1 2 蛋白酶水解唾液生物膜，p H 值与A m 的关系图柏舳帅加m6 ，97 9 D H 值图1 3 蛋白酶水解唾液生物膜，p H 值与A h 的关系图4 4 各种p H 值下三种蛋白酶水解教果参羹瓢 的统计比较在温度为2 5 “ C 磷酸钠盐缓冲液浓度为O 叭M 时，各种p H 值下三种蛋白酶水解效果参数A m 、A h
9、的统计比较见表1 9 、2 0 。对相同p H 值下，三种蛋白酶作用后膜的参数变化m 和 进行单因素方差分析，结果显示其总体均数不等或不全相等( 尸 卅矗咖，k 仰岫P ，钿 ) 咖；p H 6 9 时，弛舻魄_ 忡_ 血 ”年忡， 酗一k 嘲d t p 砷血；p H 7 9 时，慵码I - 帆珊_ 血舻，铀_ h m _ 自表1 9 各种p H 值下三种蛋白酶水解效果参数州n 咖2 ) 的S N - q 检验注t 上标相同者差异无统计学意义( 舢0 5 ) 。反之差异有统计学意义( 闷m 5 ) 。642O5 司表2 0 各种p H 值q r _ - 种蛋白酶水解效果参数A h ( n m
10、) l 拘S N K - q 检验注：上标相同者差异无统计学意义( 胗0 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( p ，0 0 5 ) 。5 不同温度下三种植物蛋白酶水解唾液生物膜的监测结果5 1 F 和D 随时间的变化曲线p H6 9 ，磷酸钠盐缓冲液浓度为O 0 lM 时，不同温度环境下，浓度为O 5 t m o lL 的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶水解唾液生物膜，由Q C M D 监测得到3 倍频下F 和D 随时间的变化曲线如图1 4 、1 5 、1 6 所示。不同p H 值三种蛋白酶水解唾液生物膜，F 和D 的测量值见表2 1 、2 3 、2 5 ，统计结果见表2 2 、2 4
11、、2 6 。对同一种蛋白酶，不同温度条件下的F 和D 的总体均数进单因素方差分析，结果显示其总体均数不等或不全相等( P ，o 0 5 ) ，说明温度与，和D 存在交互关系。采用S N K q 检验进行两两比较，结果显示：菠萝蛋白酶作用中，频率的上升幅度( H z ) 为2 5 = 3 0 00 5 ) ；术瓜蛋白酶作用中A m 和A h 都随温度的升高而增加( P 如0 5 ) ；无花果蛋白酶作用中，叫n 咖m 2 ) 为2 5 “ C 0 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( 尸( 0 0 5 ) 。表2 3不同温度木瓜蛋白酶水解唾液生物膜的F 、A D 、A m 和A h 的测量值表2
12、4 不同温度木瓜蛋白酶水解唾液生物膜的参数变化均值及S N K q 检验温度FA DA mA h( )( H z ) ( 1 0 石) ( n g c m 2 )( 衄)2 53 03 57 7 2 0 a ：1 2 5 47 2 3 ：t - 0 2 5 38 4 5 8 士0 14 b7 5 7 士0 4 0 8118 5 2 士0 4 5 。9 2 5 士O 0 5 b4 5 4 士9 84 9 2 - q ：3 b6 9 7 + 0 。3 6 3 士0 0 1 84 1 2 士0 1 6 b5 0 1 ：c - 0 0 9 。注：上标相同者差异无统计学意义( 尸 0 0 5 ) ，反之
13、差异有统计学意义( 尸叼0 5 ) 。表2 5 不同温度无花果蛋白酶水解唾液生物膜的F 、D 、A m 和a h 的测量值表2 6 不同温度无花果蛋白酶水解唾液生物膜的参数变化均值及S N K q 检验注：上标相同者差异无统计学意义( 胗0 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( 尸 所b 龇l a i n A m p 卸a i l l( P r o n l e I a i n A h p a p a i n ( P 忍b r o n l c l a i n = 办p a p a j I I ( 尸 A m p a p a i n 聊b 姗l d a i n ( P A h p 印a i n A
14、 h b 舢c l 痂( P 0 0 5 ) 。表2 7 各种温度下三种蛋白酶水解效果参数聊( n g c I n 2 ) 的S N K q 检验注：上标相同者差异无统计学意义( 尸 0 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( 尸_ ( 0 0 5 ) 。表2 8 各种温度下三种蛋白酶水解效果参数办( m ) 的S N K q 检验注：上标相同者差异无统计学意义( 胗O 0 5 ) ，反之差异有统计学意义( P O 0 5 ) 。3 9讨论1 唾液蛋白质的固定根据蛋白质与固体表面的结合方式，蛋白质分子固定于固体表面的方法可分为化学法和物理法【2 0 1 。目前，化学法的主流技术是自组装( s e
15、 l f - a s s e m b l y ，S A )技术。分子自组装指分子在氢键、静电、疏水亲脂作用、范德华力等弱力推动下，自发地构筑具有特殊结构和形状的集合体的过程，主要应用于制模技术、传感技术和微电子技术等领域【2 1 1 ，【2 2 1 。物理法固定蛋白质，主要是通过单纯的物理吸附的过程将溶液中的蛋白质固定到固体表面，再冲洗掉未吸附的部分。单纯的物理吸附，没有发生剧烈的化学反应，蛋白质分子的活性保存率高。蛋白质在固体表面的物理吸附受到环境的影响，如溶液的盐浓度、p H 值和温度等。本实验在相同的盐浓度和p H 值环境下，用Q C M D 实时动态监测相同浓度的人非刺激性唾液吸附到A u 石英晶体芯片表面，达到相同的频率改变量( A F = 1 8 0 H z ) ，通入同体积( 3m L ) 相同的缓冲液冲去松散的唾液蛋白质后形成唾液生物膜。如表4所示本研究共做1 0 8 次实验，每次在A u 表面吸附得到的唾液生物膜的质量( m )为1 0 1 7 + 3 6n c m 2 ，厚度( 而) 为9 2 1 士1 2 0n l n 。根据本实验采用的方法得到的唾液生物膜重复性好，可应用于下一步的酶水解实验。2
