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1、血浆和尿中苯并二氮杂 类药物及其代谢物的 电子捕获气相色谱筛选分析法姚丽娟3谭家镒 姜兆林 邢丽梅(中国刑警学院法医系,沈阳110035)摘 要 建立了血浆和尿中11种苯并二氮杂 类药物及其9种代谢物的电子捕获检测气相色谱分析方法。血浆及加 2葡萄糖醛酸酶水解后的尿在碱性条件下用苯2异戊醇(98. 51. 5)提取,提取物非衍生化或三甲硅烷基衍生化后进行色谱分析。分析采用两根极性不同的色谱柱。检材中分析物的检出限大多数低于10g/L ,本方法还可用于定量分析。自愿者服口服治疗量药物,其血浆、 尿中药物和代谢物的分析结果表明:本方法实用于麻醉抢劫案中的药物分析。关键词 苯并二氮杂 类药物,气相色
2、谱法,血浆,尿2003201227收稿;2003209210接受 本文系国家 “九五” 重点科技攻关项目资助课题(No.96291920120524)1 引 言苯并二氮杂 类药物,常见于成瘾滥用和麻醉后犯罪以及过量服用自杀,尤以三唑仑、 阿普唑仑、 氟 硝西泮、 氯硝西泮和地西泮等在麻醉抢劫案中使用较多。血、 尿等生物检材中,该类药物及其代谢物的分析在司法鉴定中具有重要的意义。 已报道的该类药物的分析方法有免疫分析法1、 薄层色谱法2、 气相色谱法35、 气2质联用法6和高效液相色谱法7等。本实验建立了血浆和尿中的11种该类药物及其9种代谢物的非衍生化和三甲 硅烷基(TMS)衍生化的电子捕获检
3、测气相色谱分析方法。2 实验部分2. 1 色谱仪及色谱条件HP26890气相色谱仪(美国惠普公司) ,配置 2ECD检测器和HP2化学工作站。HP25柱: 30 m0.32 mm i. d. (膜厚0.25m) ;柱温200(1 min)20/ min280(15 min) ,气化温度250,检测器温度300;不分流进样(阀关闭时间0. 7 min) ,载气高纯氮(恒压,压力116. 7 kPa) ,尾吹高纯氮(60 mL/ min)。HP250+柱: 30 m0.32 mm i. d. (膜厚0.1m) ,柱温200(1 min)20/ min280(15 min) ,载气高纯氮(恒压,压力
4、121.1 kPa) ,其余条件同HP25柱。2. 2 试剂和材料地西泮、 硝西泮、 奥沙西泮、 艾司唑仑、 阿普唑仑、 三唑仑、 氯硝西泮、 利眠宁、 氟西泮(国家麻醉品实 验中心)、 氟硝西泮、 劳拉西泮(美国新泽西州司法鉴定研究所)、12羟基三唑仑、12羟基阿普唑仑和去甲 西泮(美国Sigma公司) ,72氨基氟硝西泮、72氨基氯硝西泮、 去甲氟硝西泮、 羟乙基氟西泮、 去烃基氟西泮 和去甲氧西泮(瑞士Hoffman La Roche公司)。以上试剂分别用甲醇配制成100 mg/L标准储备液,临用时稀释成10及1 mg/L标准工作液,并根据在所用色谱条件下的tR分布,配制成各分析物浓度均
5、为10mg/L的混合标准液数种。 2葡萄糖醛酸酶(美国Sigma公司) :临用时加水配制成10000单位/ mL溶液;N ,O2双三甲硅烷基三 氟乙酰胺(BSTFA ,美国Supelco公司) :含1 %三甲基氯硅烷(TMCS) ;苯、 异戊醇、 二氯甲烷、 正己烷、 甲醇 等溶剂:分析纯试剂,蒸馏后使用;衍生化用无水乙酸乙酯:分析纯试剂,按文献8方法处理。pH 418缓冲溶液:乙酸钠(不含结晶水)41.0 g ,加36 %乙酸83.3 mL ,加水至500 mL ;pH 10.8缓冲溶液:碳酸钠(不第32卷2004年1月分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journ
6、al of Analytical Chemistry第1期913含结晶水)53.0 g ,碳酸氢钠42.0 g ,加水溶解至500 mL。实验用水为二次蒸馏水;空白血浆购自沈阳市 中心血站,含柠檬酸钠抗凝剂,新鲜;空白尿:近期未服药物健康人体排泄,新鲜。2. 3 样品处理 取待检尿1 mL放入试管中,加pH 4.8缓冲溶液50L ,加 2葡萄糖醛酸酶溶液100L ,置37 水浴 中水解14 h(过夜) ,放冷,加pH 10.8缓冲溶液0.5 mL ,或取待检血浆1 mL放入试管中,加pH 10. 8缓冲溶液0.5 mL ,加苯2异戊醇(98.51.5)5 mL ,涡旋2 min ,3000 r
7、/ min离心6 min ,分取有机相置于带1 mL 刻度尾管的20 mL鸡心瓶中,置100110 甘油浴中挥干,加无水乙酸乙酯50L溶解剩余物,抽取1L 进样,直接进行分析。剩余溶液中加入BSTFA 20L ,加塞密闭,尾管插入60 甘油浴中进行衍生化反 应30 min ,然后在缓慢的氮气流下60 挥干(除去剩余BSTFA) ,加无水乙酸乙酯50L溶解剩余物,抽取1L进样,进行衍生化而后的分析。3 结果和讨论3. 1 色谱分离 非衍生化及TMS衍生化HP25柱分析空白尿及添加标准对照品尿的色谱图如图1和图2所示。用HP250+柱分析尿的色谱图及用两支柱分析血浆的色谱图略。图1 尿液提取物色谱
8、图(非衍生化分析,HP25色谱柱)Fig.1 Chromatograms of urine extracts(underivatized analysis on HP25 column)A.空白尿(blank urine) ; B、C.空白尿添加200g/L各分析物(blank urine spiked with analytes each at level of200g/L)。色谱峰(chromatographic peaks) :1.奥沙西泮(oxazepam) ; 2.劳拉西泮(lorazepam) ; 3.地西泮(di2azepam) ; 4.去烃氟西泮(desalkylfluraze
9、pam) ; 5.去甲西泮(nordiazepam) ; 6.利眠宁(chlordiazepoxide) ; 7. 72氨基氟硝西泮(72aminoflunitrazepam) ; 8.氟硝西泮(flunitrazepam) ; 9.羟乙基氟西泮(hydroxyethylflurazepam) ; 10.去甲氧西泮(demoxepam) ; 11.去甲氟硝西泮(desmethylflunitrazepam) ; 12.氟西泮(flurazepam) ; 13.硝西泮(ni2trazepam) ; 14.12羟基阿普唑仑(12hydroxyalprazolam) ;15. 72氨基氯硝西泮(72
10、aminoclonazepam) ; 16.氯硝西泮(clonazepam) ;17.12羟基三唑仑(12hydroxytriazolam) ; 18.艾司唑仑(estazolam) ;19.阿普唑仑(alprazolam) ; 20.三唑仑(triazolam)。图2 尿液提取物色谱图(TMS衍生化分析,HP25色谱柱)Fig.2 Chromatograms of urine extracts(trimethylsilyl (TMS) derivatized analysis on HP25 column)A、B、C和峰120同图1(A ,B ,C and peak 1 to 20 are
11、the same as in Fig.1)。从表1和表2所列分析物tR数据及空白检材和添加标准对照品检材分析所得色谱图可知,在所用色谱条件下,分析物可以很好的分离,未发现杂质色谱峰干扰,国内常用巴比妥类、 吩噻嗪类等安眠镇静01 分 析 化 学第32卷药物标准品分析也未发现对本类药物及代谢物分析的干扰。3. 2 检出限 以检材中分析物色谱峰高相当于基线噪音强度3倍(S/ N= 3)的检材分析物浓度为分析物的检出 限(limit of detection或LOD) ,如表1和表2所示。表1 非衍生化分析测得的提取率、 保留时间和检出限 Table 1 The extraction efficie
12、ncy , retention time and limit of detection of underivatized analysis分析物 Analyte提取率( %) Extraction efficiency尿 Urine血浆 Plasma保留时间( min) Retention timeHP25HP250+检出限Limit of detection (g/L)尿UrineHP25HP250+血浆PlasmaHP25HP250+ 奥沙西泮Oxazepam83.380.65.655.465100436 劳拉西泮Lorazepam87.782.16.126.12742624 地西泮Dia
13、zepam86.679.86.266.35620718 去烃氟西泮 Desalkylflurazepam87.284.46.316.78320220去甲西泮Nordiazepam89.381.06.647.37425312 利眠宁Chlordiazepoxide87.780.06.707.55852806016072氨基氟硝西泮 72Aminoflunitrazepam80.377.47.097.3566944580氟硝西泮Flunitrazepam89.382.17.358.282414 羟乙基氟西泮 Hydroxyethylflurazepam90.486.67.719.008866去甲氧
14、西泮Demoxepam86.187.17.727.41950440 去甲氟硝西泮 Desmethylflunitrazepam84.683.27.9610.4141047氟西泮Flurazepam83.378.68.528.70610613 硝西泮Nitrazepam85.576.68.5511.90352512羟基阿普唑仑 12Hydroxyalprazolam83.384.18.7411.861414121272氨基氯硝西泮 72Aminoclonazepam83.377.69.2215.478767氯硝西泮Clonazepam83.685.19.3113.79676712羟基三唑仑 12
15、Hydroxytriazolam81.182.19.8618.3111161215艾司唑仑Estazolam89.090.39.9015.715332 阿谱唑仑Alprazolam87.791.110.4116.353333 三唑仑Triazolam90.090.611.7019.692822表2 TMS衍生化分析的保留时间和检出限 Table 2 The retention time and limit of detection of TMS derivatized analysis分析物 Analyte保留时间(min) Retention timeHP25HP250+检出限Limit o
16、f detection (g/L)尿UrineHP25HP250+血浆PlasmaHP25HP250+ 去甲西泮Nordiazepam5.264.475858 去甲氧西泮Demoxepam5.494.3491268 奥沙西泮Oxazepam5.794.4961046 去烃氟西泮Desalkylflurazepam6.264.39612512 劳拉西泮Lorazepam6.425.10814412 羟乙基氟西泮Hydroxyethylflurazepam7.597.034846 去甲氟硝西泮Desmethylflunitrazepam7.625.744102672氨基氯硝西泮72Aminoclonazepam7.856.20101084 硝西泮Nitrazepam8.525.956757 氯硝西泮Clonazepam9.287.048106412羟基阿普唑仑12Hydroxyalprazolam11.2614.35223212羟基三唑仑12Hydroxytri