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1、 第 18 卷 第 4 期2016 年 4 月中国当代儿科杂志 Chin J Contemp PediatrVol.18 No.4Apr. 2016292原血细胞对于儿童急性 B 淋巴细胞 白血病预后判断的价值王月芳1 江咏梅1 高举2 周平1 张鸽1（四川大学华西第二医院 1. 检验科；2. 儿童血液科，四川 成都 610041）摘要 目的 探讨儿童急性 B 淋巴细胞白血病（B-ALL）巩固化疗期骨髓原血细胞（HGs）对于儿童急性 B 淋巴细胞白血病（B-ALL）预后判断的意义。方法 回顾性分析 196 例初发 B-ALL 患儿，根据危险分型分为高危（n=55）、中危（n=69）和低危（n=
2、72）3 组；根据临床结局分为完全缓解（n=165）和复发组（n=31）。采用欧洲 BIOMED-1 标准化流式细胞术微小残留病（MRD）检测方案，检测巩固化疗期 HGs 数量。Kaplan-Meier 生存曲线统计患儿无事件生存率（EFS）。结果 高危组患儿 HGs 明显低于中危和低危组，差异均有统计学意义（P1.0% 组，差异有统计学意义（P1.0% (P1% 提示预后良好7。但目前国内尚无 HGs 与儿童 B-ALL 预后关系的研究。本研究采用回顾性队列研究，运用欧洲BIOMED-1标准化流式微小残留病 （minimal residual disease, MRD）检测技术8，通过对 B
3、-ALL患儿巩固化疗期HGs与白血病细胞的比较和鉴别，初步探讨 HGs 作为监测 B-ALL 微小残留病补充指标的临床可行性。1 资料与方法1.1 研究对象收 集 2008 年 4 月 至 2012 年 9 月 在 四 川 大学华西第二医院确诊的 B-ALL 患儿 196 例。均采用中国儿童白血病协作组（Chinese Childhood Leukemia Group, CCLG）ALL-2008 诊疗方案进行诊断、危险分型和治疗。患儿年龄 116 岁，男性128例、 女性68例。 根据危险分型分为高危 （n=55） 、中危（n=69）和低危（n=72）3 组。按临床结局分为持续完全缓解（n=
4、165）和复发组（n=31）。复发组中，髓外复发（中枢神经系统、睾丸）3 例；其中巩固化疗期 MRD0.1% 者 3 例、MRD0.1%同时伴骨髓复发者 25 例。纳入人群需进行：（1）完成 5 周诱导化疗，初诊时以及诱导化疗期每周检测12次外周血象，并行泼尼松敏感试验、第 33 天骨髓形态学和 MRD检测等；（2）完成 3 个月的巩固化疗。低中危和高危患儿分别在巩固化疗期第 1 次 HD-MTX 或HR-1 方案的第 1 天行骨穿检测 HGs 和 MRD。由于儿童 B-ALL 诱导化疗强，诱导结束时骨髓抑制严重，无法统计诱导化疗末 HGs 值。本研究获得医院伦理委员会批准及监护人书面知情同意
5、。复发标准9：完全缓解后出现以下之一判断为 B-ALL 复发：（1）骨髓幼稚淋巴细胞（原始淋巴细胞 + 幼稚淋巴细胞）5% 但 20%，予以积极治疗，骨髓幼稚淋巴细胞仍未能 20%；（3）髓外白血病细胞浸润（称髓外复发）；（4）美国 COG（Childrens Oncology Group）大样本研究报道，巩固化疗期间MRD0.1% 的 B-ALL 患者 5 年后复发率为 100%。故将巩固化疗期 MRD0.1% 也作为 B-ALL 复发标准之一10。1.2 资料收集分析收集患儿完整临床资料和随访资料，统计分析无事件生存率（event-free survival, EFS）。病例随访至复发、死
6、亡、第二肿瘤或随访截止日（2015年 9 月）。持续完全缓解组随访时间 3 年。1.3 标本采集采集患儿巩固化疗期间骨髓（EDTA 或肝素抗凝），24 h 内完成流式细胞术检测。同时制备至少 3 张骨髓涂片进行骨髓形态学检测。1.4 试剂固定破膜剂（美国 Invitrogen 公司）。单克隆抗体：胞膜 CD45、CD19、CD10、CD20、CD34、CD38、CD22、cyTdT，以上抗体均购至美国 BD Pharmingen 或 Coulter 公司。1.5 流式细胞术检测 HGs每例标本标记 6 管或 7 管，取血球稀释液稀释至浓度 1020109/L 的骨髓 100 L 与 4 或5
7、管膜表面抗体组合充分混匀，避光、室温孵育15 min，若初诊有跨系表达，加管标记分析；加入2 mLFACS溶血素 （蒸馏水1 : 10稀释） 充分混匀，静置 10 min，1 300 转 /min 离心 5 min，弃上清液；磷酸盐缓冲液（PBS）充分混匀，1 300 转 /min 离心5 min， 弃上清液；加入500 L PBS混悬， 待上机；两管胞浆抗体需加入 500 L 破膜剂静置 10 min，洗涤后加入破膜抗体室温、避光孵育 30 min，PBS洗涤后即可流式细胞仪（BD FACSCalibur）检测，记录 500 000 个细胞。利用 BD Cell QuestTM Pro 软件
8、分析数据。主要抗体组合见表 1。第 18 卷 第 4 期2016 年 4 月中国当代儿科杂志 Chin J Contemp PediatrVol.18 No.4Apr. 2016294通 过 SSC/FSC 设 门， 将 高 SSC 低 FSC 信 号的细胞碎片排除。以 CD19 设门，观察 CD19 阳性 B 细胞的免疫表型，判断是否存在异常的抗体表达。HGs 数量用正常 BCP 占骨髓总有核细胞的百分比（%）表示，包括 pro-B cells（stage ）：CD10+CD20-CD34+CD38+CD22+TdT+CD19+；pre-B cells（stage ）：CD10+CD20+C
9、D34-/loCD38+ CD22+TdT+CD19+；immature B cells（stage ）：CD10+CD20+CD34-CD38+CD22+TdT+CD19+ 1-2,4,11-13。因本研究的 pre-B cells 和 immature B cells 采集位点有重叠 （图1 E1、 E2） ， 故将这两阶段细胞合并分析。在正常细胞表达模式之外出现的异常细胞群视为MRD 细胞（图 1 R1R22），超过 15 events 成簇分布视为异常，总计超过 50 events 判断为有临床意义。1.6 统计学分析统计学处理采用 SPSS 17.0 软件完成。非正态分布计量资料用中
10、位数（范围）表示，计数资料用百分率（%）表示。多组比较采用校正检验或 Fisher 确切概率法。对于连续变量，利用 Mann-Whitney U 检验进行两组间比较、Kruskal-Wallis test 进行多组间比较。相关分析采用 Pearman 等级相关分析法。生存曲线采用 Kaplan-Meier 分析。P0.05）。2.1 各组间 HGs 差异比较低、中、高危 3 组的总 HGs 逐步降低，差异有统计学意义（P 0.05）。见表 2。表 2 不同危险组患儿 HGs 比较 中位数 ( 范围 )，%分组 例数总 HGsstage + stage 低危723.60(0.0228.82)1.
11、98(0.0227.19) 1.08(0.005.97)中危692.20(0.0436.12)0.80(0.0233.15) 0.84(0.025.02)高危551.09(0.0345.91)a,b1.15(0.0243.81) 1.21(0.007.73)2值8.822.360.42P 值 P1%（n=127） 患 儿 的 EFS 差 异， 显 示HGs 1% 组 EFS（72.3%） 明 显 低 于 HGs1%组（90.1%）， 差 异 有 统 计 学 意 义（2=7.597，P=0.006）。见图 2。图 2 各组 B-ALL 患儿 EFS 分析 A：将患儿分为HGs 1%（n=69），
12、1%5%（n=70）6 组，以 HGs 1% 组 EFS 最低；B：以 HGs 1%为界，HGs 1% 的 EFS 低于 HGs1% 者。196 例患儿共有 31 例（15.8%）复发。完全缓解组的总 HGs 表达明显高于复发组，差异有统计学意义（P0.05）。见表 3。2.2 各组 B-ALL 患儿 EFS 分析为寻找 HGs 的最佳临界值，将患儿分为HGs 1%（n=69），1%5%（n=70）6 个 组3 讨论B-ALL 是最为常见的儿童血液肿瘤，近年依据早期治疗反应来指导临床危险度分型和个体化治疗的观念受到广泛关注。HGs 为骨髓中正常 B系前体淋巴细胞， 体积差异较大， 染色质致密均
13、一、胞浆量少、 核仁不明显， 很难仅根据形态学与B-ALL幼稚细胞鉴别。由于白细胞抗体重叠、漂移等现象可影响流式细胞术 MRD 准确度，导致形态学显示完全缓解而 MRD0.1% 的不一致性14-15。本研究通过相关性分析发现，HGs 与骨髓幼稚淋巴细胞呈正相关，提示 HGs 是导致形态学与 MRD 不一致的可能原因。不一致的 29 例中仅 4 例复发。提累积生存率累积生存率1.00.80.60.40.201.00.80.60.40.200 500 1 000 1 500 2 000 2 5000 500 1 000 1 500 2 000 2 500生存时间（d）生存时间（d） 1 1 2 2
14、 3 3 4 4 5 5 1.0 1.0HGsHGs第 18 卷 第 4 期2016 年 4 月中国当代儿科杂志 Chin J Contemp PediatrVol.18 No.4Apr. 2016296示临床不能单纯依据骨髓形态学判断复发，需结合流式细胞术 HGs 分析以鉴别幼稚细胞与正常 B系前体细胞。大量 HGs 多出现于化疗后再生的骨髓3-6。国外已有报道指出，HGs 与 AML 的预后相关5-6。但由于 HGs 与 B-ALL 幼稚细胞在形态学上很难鉴别6，仅有个别报道 HGs 在成人 B-ALL 的预后意义16。但有研究报道，欧洲 BIOMED-1 标准化流式 MRD 检测技术可准
15、确鉴别 HGs 与 B-ALL 残留白血病细胞（准确率达 98%）8。本研究采用欧洲 BIOMED-1 标准化流式 MRD 检测技术，以B-ALL 为研究对象，检测巩固化疗期的 HGs 并分析与 EFS 的关系。结果显示，高危患儿的 HGs 明显低于中、低危患儿，提示骨髓 HGs 与 B-ALL 的危险度存在一定相关性；完全缓解组的 HGs 明显高于复发组，提示 HGs 增生反映化疗效果良好，可用于 B-ALL 患儿疗效判断及预后监测。有研究显示，AML 诱导化疗后 HGs0.01% 的患儿总体生存率和无病生存率明显高于 HGs0.1% 的 AML 预后良好17。Chantepie 等16报道
16、，MRD 阴性且 HGs 阳性的成人 B-ALL 总体生存率和无病生存率高于 HGs 阴性者。本研究发现，HGs1% 的 B-ALL 患儿 EFS 明显高于 HGs 1% 者，本研究 HGs 临界值高于文献报道 5-6,17-18， 可能与儿童骨髓HGs较成年人高2,4、并且巩固化疗期的骨髓较诱导化疗末增生更活跃有关。综上，HGs 可反映 B-ALL 疗效，可作为 B-ALL疗效及预后监测指标。流式细胞术检测 HGs 需要多抗体联合标记，且抗体组合多样，但各实验室常常根据自身需要采用不同的抗体组合模板，容易造成结果差异。因此需要标准化流式检测方案，欧洲 BIOMED-1 流式 MRD 检测方案易于形成标准化，使 HGs 用于 B-ALL
