《青贮用纤维素分解工程乳酸菌的构建》由会员分享，可在线阅读，更多相关《青贮用纤维素分解工程乳酸菌的构建（62页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、卜、-J1I | 1 l l lIII 2 7 3 目录目录中文摘要I英文摘要l I I1 弓I 言11 1 立题背景11 2 研究进展51 2 1N I C E 系统的概况和重组乳酸菌的研究进展51 2 2R E A I 用M Eq u a n t i t a t i v eP C R 应用的研究进展81 3 目的与意义1 01 4 研究的内容1 02 材料与方法。1 12 1 材料与仪器：1 12 1 1 实验菌株、质粒和引物。1 12 1 2 试剂、工具酶和试剂盒1 12 1 3 培养基配制和主要溶剂配制1 22 2 实验方法1 42 2 1C B HI I 基因的克隆1 42 2 2
2、含有重组质粒p E T C B H 的R o s e t t a 工程菌的构建1 72 2 3 对含有重组质粒p E T C B H 的R o s e t t a 工程菌进行诱导及活力测定1 82 2 4 乳酸乳球菌N Z 9 0 0 0 感受态的制各2 02 2 5 利用p N Z 8 1 4 8 表达引物亚克隆C B H 基因2 02 2 6 亚克隆C B H I I 基因回收、连接和宿主菌的转化2 02 2 7 工程乳酸菌阳性克隆的验证。2 12 2 8 利用R E A I ，n M E R T P C R 对工程乳酸菌C B H I I 基因进行定量分析2 12 2 9 对含有重组质粒
3、p N Z C B H 的工程乳酸菌进行诱导及目的蛋白检测2 43 结果与分析。2 63 1 梯度P C R 确定扩增C B HI I 基因最佳退火温度2 63 2C B H I I 基因P C R 扩增产物与T 载体连接、转化后的克隆2 73 3 验证提取克隆的质粒p E T C B H 2 83 4 蛋白质电泳( S D S P A G E ) 检测R o s e t t a 工程菌表达的蛋白2 93 5p N P 标准曲线绘制结果2 93 6R o s e t t a 工程菌表达的C B HI I 酶活性检测结果3 03 7 克隆C B H I I 基因与p N Z 8 1 4 8 载体
4、连接、转化后的克隆3 03 8 利用R E A L 广T I M ER TP C R 对T 程乳酸菌C B HI I 基因进行定量分析3 13 8 1 不同方法提取工程乳酸菌总R N A 质量的比较3 13 8 2 绝对定量标准曲线的制各3 2东北农业大学理学硕士学位论文3 8 3R T 样品与扣除部分样品C t 值的测定和换算3 33 8 4 本实验方法的稳定性、重复性检验及R E A L - T I M EP C R 产物的特异性检测3 43 9 蛋白质电泳( S D S P A G E ) 检测工程乳酸菌目的蛋白表达情况。3 64 讨论3 74 1 关于实验材料的选择3 74 1 1 纤
5、维素酶C B HI I 基因的选择3 74 1 2p E T 载体和R o s e t t a 宿主菌的选择3 74 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的染色方法3 84 3 利用荧光定量分析目的基因的表达。3 84 3 1 工程菌总R N A 的提取方法3 84 3 2 荧光定量分析方法3 94 3 3R E A L - T I M ER TP C R 定量基因表达与传统转录水平分析基因表达的比较4 05 结论4 1致谢4 2参考文献4 3p f I 录4 7攻读硕士学位期间发表的论文4 9， C O N T E N T SC O N T E N T SC h i n e s e A b s t r a
6、 c t 。IE n g l i s hA b s t r a c t I I I1I n t r o d u c t i o n 11 1B a c k g r o u n d 11 2P r o g r e s s 51 2 1N l C Es y s t e ma n dp r o g r e s so fe n g i n e e r e dl a c t i ca c i db a c t e r i a 51 2 2P r o g r e s so fa p p l i c a t i o no fR E A L T I M Eq u a n t i t a t i v eP C
7、R 81 3A i m sa n ds i g n i f i c a n c e sM a i nc o n t e n t s 1 01 4M a i nc o n t e n t sP r o g r e s s 1 02M a t e r i a l sa n dM e t h o d s 1 12 1E q u i p m e n t sa n dm a i nm a t e r i a l s 1 12 1 1M a i ns t r a i na n dv e c t o r sa n dp r i m e f s 1 12 1 2M a i nr e a g e n t sa
8、n de n z y m e s 1 12 1 3P r e s c r i p t i o no fm e d i u ma n dr e a g e n t s 1 22 2M e t h o d s 1 42 2 1C l o n eo fC B HI Ig e n e 1 42 2 2C o n s t r u c t i o no fv e c t o rp E T C B Hi nR o s e t t a ，1 72 2 3I n d u c e m e n ta n dd e t e r m i n a t i o no fr e s t r u c t u r e dR o
9、s e t t a 1 82 2 4P r e p a r a t i o no fL A BN Z 9 0 0 0c o m p e t e n c e 2 02 2 5S u b c l o n eo fC B Hg e n eb yp r i m e r s 。2 02 2 6R e c y c l ec o n n e c t i o na n dt r a n s f e c t i o no fC B HI I 2 02 2 7D e t e r m i n a t i o no fp o s i t i v er e s t r u c t u r e dN Z 9 0 0 0 2 12 2 8A n a l y s i so fr e s t r u c t u r e dN Z 9 0 0 0b VR E A I ，- T I M ER TP C R 2 12 2 9I n d u c e m e n ta n dd e t e r m i n a t i o no fr e s t r u c t u r e dN Z 9 0 0 0 2 43R e s u l t sa n da n a l y s i s
