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1、 结果- 5 1附图B OOOOO OOOOO O 5 3讨论6 1硝、结”“”6 3参考文献OOOOO O 6 4第三部分T G F p1 在过氧亚硝基阴离子致糖尿病肾病损伤中的作用前言”“”“”O O ogOOOOO OOOOOO ”6 7刚舌”“”“”“”“”“”。”材料与方法6 8结果7 3附图7 5附表8 125689788888800ll1 r 一r 舀展一茳，1，U一一究_Lr砂子- 一葛离11】一阴_ - 一基中文摘要过氧亚硝基阴离子介导糖尿病肾脏损伤机制的研究摘要目的：糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ，D M ) 是病死率最高的前三位严
2、重疾病之一，糖尿病人发生血管并发症( 包括微血管病变和大血管病变) 的风险比非糖尿病者高2 4 倍。糖尿病肾病( d i a b e t i cn e p h r o p a t h y , D N ) 是糖尿病患者发生的常见而难治的慢性微血管并发症，也是糖尿病致死、致残的重要原因。目前认为，D N 的发生和发展是在遗传背景基础上，多因素综合作用的结果，包括肾组织糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、肾脏血流动力学异常等，其中氧化应激( o x i d a t i v es t r e s s ，O S ) 已被认为是D N 的重要发病机制之一。氧化应激是指机体或细胞内自由基产生与消除失衡，或外源性氧化物质
3、的过量摄入，导致活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，R O S ) 或活性氮( r e a c t i v en i t r o g e ns p e c i e s ，R N S ) 等产生过多，而引起的细胞毒过程。过氧亚硝基阴离子( p e r o x y n i t r i t e ，O N 0 0 ) 是R N S 的重要成员之一。研究发现，糖尿病时诱导型一氧化氮合酶( i n d u c i b l en i t r i co x i d es y n t h a s e ，i N O S ) 活性增高，导致N O 的过量产生。
4、过量的N O 可与0 2 。快速反应生成O N 0 0 “ 。O N 0 0 可作为强氧化剂或蛋白质硝化剂，造成许多重要的生物大分子结构修饰或功能障碍。其中蛋白质酪氨酸残基可被O N O O 。硝化形成3 硝基酪氨酸( 3 n i t r o t y r o s i n e ，3 - N T ) ，因此，N T 常被作为体内O N O O 。生成的生物标志物。近年的研究发现，O N 0 0 参与了动脉粥样硬化、急性肺损伤、败血症、休克、缺血再灌注损伤及帕金森症等多种疾病的发生发展。其中愈来愈多的研究证实，O N 0 0 。在糖尿病及其并发症中发挥了重要的作用。但目前O N 0 0 “ 与D N
5、 的关系鲜有报道，对O N 0 0 。致D N 发病的具体机制更是知之甚少。目前已知的O N 0 0 。致病理损伤的机制主要涉及：抑制蛋白质活性、导致脂质过氧化、引起D N A 裂解、干扰线粒体能量代谢及诱导真核细胞凋亡或死亡等。近年的研究表明，O N 0 0 。在多种细胞信号转导途径中同样发挥重要的调控作用，如M A P K 信号途径、P 1 3 K A k t 信号途径、N FKB 信号途径等。0 N 0 0 通过激活或抑制信号转导，参与众多疾病的发生发中文摘要展。最近，P l a t tD H 等发现O N O O 。在血管内皮细胞可通过激活S T A T 3 增加V E G F 的表达
6、。值得注意的是，J a n u sk i n a s e ( J A K ) s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n ( S T A T ) 信号途径的激活会促进肾小球系膜细胞( m e s a n g i a lc e l l ，M C ) 的生长及增生，导致T G F 1 3 1 及细胞外基质蛋白如纤连蛋白( f i b r o n e c t i n ，F N ) 等分泌增加，从而参与D N 的发生发展。 J j 埘S T A T 信号途径是否参与O N O O
7、 。介导的糖尿病肾损伤? 尚未见报道。大量研究表明，T G F p 作为J A K S T A T 信号途径重要的下游调控分子在D N 中发挥着重要作用。T G F p 可以刺激M C 产生细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，E C M ) 如胶原、层粘连蛋白及F N 等，导致基底膜增厚、系膜区扩增及纤维化。此外，T G F p 还参与介导高糖环境下M C众多基本生物学行为，如增生、肥大及凋亡等。研究发现，T G F B 可诱导细胞周期负性调节蛋白( C r d ) 表达增高，从而抑$ I J c y c l i n C D K 活性，阻碍
8、细胞周期G 1 S 期的转化，导致细胞增生受抑。同时，K h e r aT 等发现，T G F p 1 可诱导M C 凋亡。研究证实，M C 的增殖和凋亡等生物学行为与D N密切相关。因此，鉴于T G F D 在糖尿病肾病E C M 病变及介导M C 生物学行为中发挥的重要作用，O N 0 0 。激活J A K S T A T 信号通路后是否通过诱导T G F D ，从而参与糖尿病肾损伤? 目前尚未见相关报道。本实验应用糖尿病大鼠模型和体外培养的人肾小球系膜细胞 ( 蹦C ) ，从整体、细胞和分子三个水平，系统观察糖尿病肾病大鼠肾组 织及高糖刺激下的删C 中O N 0 0 。、J 削刚S T
9、A T 信号途径及其下游信号分子T G F 1 3 1 、F N 的表达情况以及高糖对H M C 增殖、凋亡的影响；同时应用O N 0 0 。的特异性清除剂尿酸( u r i ca c i d ，U A ) 和J A K 2 的特异性抑制剂A G 4 9 0 进行干预，观察相应指标的变化情况。以探讨O N O O 。在D N 损伤中的作用；J A K S T A T 信号途径及其下游信号分子T G F p 1 、F N 是否参与了O N 0 0 。介导的D N 的病理损伤，旨在深入阐明O N O O 。在D N 中的作用及其具体机制，并为D N 的药物开发提供新思路。方法：1 动物模型的建立及
10、血、尿生化指标测定W i s t a r 雄性大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组( D M 组) 和尿酸组( U r a t e 组) 。D M 组大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素4 0 m g k g ( S T Z 溶于中文摘要O 1 m o l L 枸橼酸盐缓冲液中，p H 值4 4 ) ，对照组只注射等剂量枸橼酸盐缓冲液，U r a t e 组按4 0 m g k g 腹腔注射S T Z ，并用尿酸水溶液灌胃( 1 6 0 m g k g d ) ，同时对照组和D M 组大鼠灌以等剂量水溶液。7 2 h 后测定空腹血糖和尿糖，空腹血糖值13 m m o l L ，尿糖值H + 洲者确定为D M
11、 模型。糖尿病大鼠模型建成后1 3 周，每组取5 只大鼠称重，分别用代谢笼收集2 4 h 尿，用于测定尿蛋白( U p r o ) 和尿肌酐( U e r ) ；股动脉取血，分离血清，用于测定血糖( G l u ) 、尿素氮( B U N ) 和血肌酐( S c r ) 。2 肾组织常规病理学观察、O N O O “ ，J A K S T A T 信号途径及其下游信号分子T G F p l ，F N 表达的检测糖尿病大鼠模型建成后1 3 周，正常对照组、D M 组和U r a t e 组每组各取5 只大鼠称重，切取肾脏，取部分肾组织置于4 多聚甲醛或2 戊二醛固定，用于光镜、透射电镜的常规病理
12、学观察；免疫组织化学染色法检测N T 总蛋白( O N O O 。的标志物) 的表达；取部分肾皮质组织提取总蛋白，W e s t e r nb l o t 检测N T 总蛋白、J A K 2 、P J A K 2 、S T A T l 、P S T A T l 、S T A T 3 、P S T A T 3 、T G F 9 1 及F N 蛋白表达；取部分肾皮质组织提取总R N A ，半定量R T - P C R 检测T G F 。1 3 1 m R N A 和F Nm R N A 表达。3 体外培养H M C 中O N O O 。、P J A r , 2 p S T A T 3 、T G F
13、 91 及F N 蛋白表达的检测应用含1 0 胎牛血清及1 0 0 k U L 青霉素、1 0 0 m g L 链霉素的R P M I1 6 4 0 培养基对H M C 培养。体外培养H M C 融合到7 0 8 0 后，用无血清R P M l l 6 4 0 培养基同步培养2 4 h ，之后将细胞分成5 组：正常对照组( 5 5 m m o l L 葡萄糖) ；高糖组( 3 0 m m o l L 葡萄糖) ；甘露醇高渗对照组( 5 5 m m o l L 葡萄糖+ 2 4 5 m m o l L 甘露醇) ；高糖+ A G 4 9 0 组( 3 0 m m o l L葡萄糖+ 1 0 p
14、m o l LA G 4 9 0 ) ：高糖+ 尿酸组( 3 0 m m o l L 葡萄糖+ 1 0 0 I - t m o l L尿酸) 。分别在6 孔板和2 5 c m 2 塑料培养瓶内培养，培养1 2 、2 4 、4 8 h 倒置显微镜观察细胞形态学改变；培养1 2 、2 4 、4 8 h 分别收集细胞及其上清液、提取细胞总蛋白。采用免疫细胞化学和W e s t e r nb l o t 检测N T 总蛋白、P J A K 2 、P S T A T 3 、T G F 1 3 1 蛋白的表达；采用酶联免疫吸附实验( E L I S A )检测细胞上清液中T G F 1 3 1 及F N 蛋白的含量。4 体外培养H M C 增殖和凋亡的检测中文摘
