《苏云金芽孢杆菌vip3A基因鉴定、克隆及杀虫活性分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《苏云金芽孢杆菌vip3A基因鉴定、克隆及杀虫活性分析（82页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、摘要本职究系统地进行了v 捌基因的P C R R F 糟( 多聚酶链反应。限制性片段长度多态性) 蘩定，目前，函内外还未觅正式报道。通过此方法对实验室保存的6 0 6 株苏云金芽孢秆菌( 曰甜c 川螂f A “砌嘿陋脚拈，简称B t ，) 菌撩的v 瓣妇( 营养期摹虫援瞧；v 臻)基因型进行了鉴定；对擞A L 和B t 4 聪B l 蕊株搿含的c 秽和r 和鲥基因型主挂行了鉴 定；完成了蔼株B t A L 蟑d 省基阂的克陵、表这及时甜菜夜蛾( 勋。却据M 甜嚼) 、 稀铃蛰t t c 洲e r p an r m t g e r G ) 、小蒜蛾tP i H t e l i n 础l o s
2、l e l i n ) 瓤玉卷啜to s 扣妇d力”球棚凰) 幼虫的生物活性测定；并克隆得劐B t 4 lt 扣v 加触的基因片段。本磅究建立了P c R * R F L P 的方法，筛选v 弘珏基因。j 魄方法根据五种v 枷谢基因的保守区设计一对通用S f 物，丽来扩增v 秘列基因的l ，4 5 6b p s 的基因片段，此片段经胁，d I J J 和点亡D Rl 双酶切后，电泳捡测酶切条荣大小，根掇电泳图谱，确定基因类型。通过北方法，从签定懿6 0 6 株B t 替株中有3 8 2 株得到v 扫蒯基函扩增产物，约占总数的6 3 ，说明v 啦荆基因的分布广泛。根据酶切电泳显示，共有三种R F
3、 L P 图谱，3 1 5 株含有与已知v 护3 爿群楣同的电泳匿谱( 8 6 0 ，2 6 0 ，1 9 0 和1 6 0b p s ) ，另外发埂嚣弛藜的R F 磐图谱与已知5 种基因不霹，其中5 2 株( 含麓株B t A L ) 静惫泳图谱箍示8 6 0 ，2 醐，1 6 0 ，1 5 0 b p s 条带；l5 株( 仑菌椿B t 4 1 ) 的电泳图谱显示l ，1 0 0 ，1 9 0 和1 6 0b D s ，均不同于其他已知v 细捌的R F L P 图谱。 对含有新嘲烈基因的B l A L 菌株屡粒D N A 进行c 帮v 秘蒯基因鉴定，发现其 台奄汀v j 矗b ，c w i
4、 C a ，州j c b ，c H i 硒，c 搿i B d ，c w l 珞，c r v 2 A b ，州9 翰耨颓艇v p 3 A基因。以B n L 菌株质粒D N A 为模板扩增锝到2 3 7k bv 珈弘基因产物，撼入到表达 载体p E 豫1 b 上，褥到熏组质粒p 8 v 簪，宠成宠隆移测廖，并将穿刭提交G e n 转a 呔登记，A c c e s o nn u m b e r 为D Q 2 4 1 6 7 4 ，嚣船f 帮鄹捕“r 懈沱瑚商杀虫晶体蛋囱命名委员会命名为v i p 3 A a l 9 。序捌分析表明V i p 3 A a l 9 蛋自由7 8 9 个氨基酸组成，分予量
5、为8 8 ，7k D a ，该蛋白等电点为p H 5 1 7 ，为弱羧性蛋自。与所有的v i p 3 类蛋| 皇作了网源关系分柝，此蛋白与融知v i p 3 A a 2 共有最高为9 7 6 酌序确同源往，存在1 9 个氨基酸残基的不同。将含有p B v j p 质粒的大肠杆菌在O 7m m o l LI P T G ，1 8 ，1 3 0f m i n 条停下，诱导表达1 8 小对，提取表达产物，s D s P A I l 3 匿分极表明v 秘3 9 搿j 9 基因程置露中表达蛋自为可溶的。生物活性测定表晴表达产物对甜菜夜蛾幼虫其有显著酌杀虫活髋，L c 5 0 为1 4 3n m g 饲料
6、；对棉铃虫和小菜蛾幼虫也具有显著的系虫活性，L c 5 0分别为2 4 1 4n m g 饲料期5 9 + 8 2 牡g ，m L ；但此蛋自慰玉米蜞淫蛙不寒，K 5 。大予l 毡幽L ，只具存一定的体重抑制作翔。对含有新v 秘纳基因的B t 4 l 菌株质粒E I N A 进行c 砂和v 弘妇基因鉴定，发现菌株B t 4 l 禽商c w J 爿爿，e 拶J C 毋，c 蛆 秘一耪毅型v i p 弘基因。并从B 描l 菌株中竟隆得到了v 弘的基豳片段 ，4 S 6b p 嚣，溅序结果显示其蛋自序猁与已l 知V j p 3 A f l 其有8 3 的序列同源往。在G e n B a n k 登记
7、，A c c e s s i o nn 啪b e r 为D Q 2 5 0 2 5 6 本研究发现了两种新的v 功鲥新摹西，完成了v 弘谢d ，_ 9 基因的克隆及活性测定，确定了对鳞翅强鼹虫烈菜瘦峨的寒毒力。由于爨藻夜蛾是一类危害极其严羹、抗性上毒舞较狳翁毽秀毽害虫，慈瑰鸯豹B l 产熬难该类害塞瓣匿闯防效较嚣，赝敷，照纂因戆发蠖对于稳菜疲滚嚣茨滚翼毒耋簧焱义。荚键词：苏云金芽孢争于菌；营养期恭窳鬃囱；甜菜夜蛾；，j 、菜蛾；v i p 3 A a l 9i d e n t i f i c 锺t i 蛐，c l o n i n ga n d 删V i | i e so f 咄泌g c n e
8、 sf r o 硼踟e 鳓s 珐嚣嘲妇s 螽A m h o r ：j i n h u a n 乙i uS u p e r v i s o r ：A s s o c i 如P r o f J i 粕x 遮慨，A s s o e 蹴p 娥F 坤豫S 鳓gM a j o r ：M i c r o b i o j o g yA b s n c t确ev 驷削* g e n et y p e si nt h e 舶c 讲淞折“r 嘲妇琳豇( B t ) s t r a i n sw e f es c r e e n e db yn s i 耀P C R I R F L P ( p o l y m 捻s
9、e 陡a i nr e a e t i o n - r e 髓r i c i b n 晌g m e n t1 e n g t hp 0 1 y m o 啦i s m ) m e t l l o d W i d e n t 湎e dt h e 7a n dV 毋副g e n et y p e so fs t r a i n sB t A L8 聪B t 4 l ，弧ep 弘联g e 黼法 B t A 毛啪sc l o n 酣，e x p r e s s e 娃a n di 拈t o x i c 酊t o 酗D 痂P 加船j g 枷，胁玩o w 伊n 棚行啦阳， j 吖删g ，撕咖抛抛a n d
10、( b 妒加如乒f r 舡球。d ，虹警姑r es t u d i e d w eo b t a i 狂e d _ l ，自心鐾e 砖e 珏g m e n o f B t 4 1 P c R R F L PW a su s e dt of a p i d l yi d e n 鼍i f y 踟o f 踟5 珐甜r 裙f e 璐嚣s t 糟i n sh 赫o r i n gh lo rn o w lv 3 一t y p eg e n e s Ap a i ro fu n i v e r s a lp r i m e f sw a sd e s i g n e db 袅s e do ne o n
11、s 蹦v e dr e g i o n so f 蠡v e 却；_ g e n e s A m p l i 瘀e d 湖d u e t s ( 1 ，4 5 6b p s ) d i g e s t e dw i t hl h e 手抒H d l l Ia n d凰口RIe I l z y m e sw e r er u no na g a r o s eg e l ss oa st oc o 蝴雕d i f & r e n t 艘L Pp a 搬限s ru s e d 协i d 锄t i 移V 缸跏一t y p eg 鞠e so f 最髓耵砸膨瑚括s t r a i n s T h eV 勿
12、鲥g e n e t y p e so f6 0 6最f 厶”r 媳妇燃拇s t f a 蕊r es c f e e H e da n dl h f e ep a 圭t e m so f 灯L Pw e f es 鞋c c e s s 矧yi d e n t 涵e d At o t a lo f 3 S 2s t r a i n sh a r b o r e dv 多捌g e n e s ，b a s e do nap o s i t i V eP C Rs i g n a l ，删也e 聪烈l t si n d i e 艇e dt h a ll kv 扣鲥g e 娃eh a daw 谄ef
13、a n g eo fd i s 蜥h l t i o n 0 ft h e s es 仃a i n s ，a g a m s eg e ld a t ac o n n m e d315i S o i a t e sb a dav 勿鲥辟t y p eR F L pp a n e 趣( 8 6 0 ，2 6 0 ，1 9 0鞣d ! 鳓坤s ) ，e 黼f o 黼 n 蠡t o 氆ep r e d i c t e d 蠢a 辨e n t so fV 渊口7 一t y p eg e n e s 5 2s t r a i n s ，i n c l u d i n gs t r a i nB t A
14、Ls h o w e dan o V e lv f 妒蠢- t y p eR F L Pp a 挂e m ( 8 6 0 ，2 6 侥l6 0 ，l5 0b 弘a n dm o r es h o r t e r 衲g m e n t s ) As e c o n dn o v e lv 驷翩一妙p ep a t t e m ( 1 ，l O O ，1 9 0a 1 1 d1 6 0b p s )w a sa l s oi d e n t i f i e d 速l5 s o l 毅e si n e l u d i n g 最珐封r f 耀撂掰矗B 礴1 w ef 曲n dt h a ts t r
15、 a i nB 认Lc o n t a i n i n gc 掣似槐，o ，c 秒，咄J 鼬，c 掳醴c 秒J 然 e f 删致e 拶她6a 珏dn 错l ev 缸澍g e n e s h f o u g l li d e m i 蠡i n gf 矽a 1 1 dV 鲥g e n et y p e so fp l a s m i dE 瞳q Ao fB t A L A2 3 7 k bV 本 王4l 弦n eP e Rp f o d t l c t 、垤sa n p l i e dw i t hp 1 8 s m i d D N Ao f B t A La s e m p l a t e I
16、tw a si n r t e di n t oav e e t o rp E T - 2 1 b 1 1 1 en u c l e o t i d es e q u e n c ed a t ao fV i p 3 A a l9w e f ea s s i g n e dG e 致B a 芏波筑c e e s s 呈o nn H m b e r sD ( 配4 1 6 7 4 s e q 韬e n e ea n 稿v s e ss h o w e d 也a tv 细j 一蹿，9p r o t e i nc o n s i s l e do f7 8 9r e s i d u e so fa I I l i n oa c i d sw i map r e d i c 托d 拜l o l e c u l 嚣i 曲to f8 8 7k D aa n 鑫i s o e l e c 嘶cp o
