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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。刀L 论文作者签名：望! 生日期：出羔：三：；中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证
2、毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。一，论文作者签名：望! 幺指导教师签名_ 畜勰禽瑙 0 0 5 ) ( 表2 ) 。1 9 -表2S P C A 一1 细胞转染后M T r 结果( i S ，n = 8 )组别转染后不同时间点的细胞生长抑制率( )2 h6 h1 2 h2 4 h三、l i T P C R 方法检测c F L I Pm R N
3、 A 表达情况R T P C R 结果可见L i p o A S O D N0 5 、1 O 、2 0 L M L 浓度组均可见c F L I P 。，L m R N A 表达降低，且其抑制程度随浓度的升高而增加( 图2 ) 。图2S P C A l 细胞转染2 4 h 后R T P C R 法检测c F L I P 虮m R N A 表达量其中2 a 为e F L I P 。m R N A 表达量；2 b 为c F L I P s m R N A 表达量。2 0 四、W e s t e r nB l o t 法检测c F L I P s 和c F L P L 蛋白表达L i p o A S
4、O D N0 5 、1 o , 2 0 1 x M L 浓度组均可见c F L I P s L 蛋白表达下调，且其抑制程度随浓度的升高而增加( 图3 ) ，但L i p o A S O D N 抑制c F L I P s 作用更加明显，抑制c F H P 。作用并不显著，但是有抑制趋势。L i p o N A S O N 各组未见c F L I P L s 蛋白表达有改变。图3S P C A 一1 细胞转染2 4 h 后W e s t e r nB l o t 检测c F L I P S ，L 蛋白质表达量其中3 a 为c F L I P 。蛋白质表达量；3 b 为c F L I P 。蛋白质
5、表达量。讨论反义药物是以反义核酸技术为基础开发的、以治疗为目的、安全有效的新型药物。近年来，随着对反义寡聚脱氧核苷酸( o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ，O D N ) 及其结构衍生物如硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸( p h o s p h o r o t h i o a t eo l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s ，P S O D N ) 反义作用机理的阐明，大批以病毒、癌基因、细胞活性因子及其他疾病相关蛋白的基因为靶点的反义药物相继进入临床试验阶段，使反义药物的研究再次进入蓬勃发展时期“ J 。反义
6、核糖核酸( 反义R N A ) 的作用机制还不十分清楚，其可能作用于靶的下列区域而发挥抑制功能：m R N A 5 端非翻译区；m R N A 编码区，主要是起始密码A U G ；m R N A 5 末端帽子形成位点或3 端非翻译区，同反义D N A 相比较，反义R N A 具有两方面的差异。一方面，反义D N A 分子到达细胞相应部位即可发挥作用，但是反义R N A 分子很少直接应用。尽管经化学修饰增加了稳定性的R N A 分子可直接应用，但更常见的是通过含有效应R N A 分子的载体转染到目的细胞，导人到细胞内的基因转录出具有治疗作用的R N A 分子，并在细胞内提供持续的治疗效果。另一方
7、面，作用方式2 l 不同。反义D N A 治疗效应中起关键作用的是R N a s e H 不识别R N A 分子，对于反义R N A 来讲其治疗效果可能依赖作用于d s R N A ( 双股R N A ) 酶，决定于细胞内酶的构成，动力学和酶促反应的平衡及细胞内d s R N A 的位置和浓度7 只1 0 】。人F l i p 基因含1 3 个外显子，与C a s p a s e8 基因均位于染色体的2 q 3 33 4 ，两者相距约2 0 0 b p 。F l i p 蛋白在结构与序列上也与C a s p a s e8 有很多相似之处，其N 端含有与C a s p a s e8 相似的两个相
8、互串联的死亡效应结构域D E D ( d e a t he f f e c t o rd o m a i n ) 。每个D E D 含有4 0 个氨基酸，D E D 与F a s 的死亡结构域( d e a t hd o m a i nD D ) 的功能相似，能介导蛋白质之间的相互结合。在人类组织和细胞系中，c F L I P 基因表达多种拼解体m R N A ，但其蛋白产物只有两种。较短的蛋白称为c F L I P s ( c e l l u l a rF L I PS h o r t ) ，分子量约2 8 k D ；较长的蛋白称为c F L I P L ( c e l l u l a rF
9、 L I Pl o n g ) ，分子量均约5 5 k D 【1 。c F l i p s 只有2 个D E D 而c F l i p l 除2 个D E D 外还含有一个C a s p a s e 同源结构域，即C a s p a s e 蛋白水解酶区。细胞凋亡依赖与C a s p e s e s 来降解细胞蛋白质。在C a s p e s e s 家族中，C a s p a s e8 最为重要。在死亡受体介导的胞细胞凋亡中，F a s 引导的细胞凋亡研究的最为广泛。F a s 是一种跨膜蛋白，它具有特殊的 D D ，F a s 的D D 可与F A D D ( F a s a s s o
10、c i a t e dd e a t hd o m a i n ) 的C 端D D 接头分子结合并发生多聚化作用，形成死亡诱导信号复合物( d e a t hi n d u c i n gs i g n a 1 i n gc o m p l e x ，D I S C ) 。F A D DN 端的D E D 通过同种蛋白相互作用机制吸引其下游分子C a s p a s e8 。C a s p a s e8 与D I S C 结合后，自身被降解而激活，激活的C a s p a s e8 亚基释放到胞浆中，能够激活C a s p a s e s 的级联反应并诱导细胞 凋亡。c F L I P 上的D
11、 E D 可竞争性结合F A D D 上的D E D ，或与C a s p a s e8 上的D E D 结合。因而c F L I P 能阻断F A D D 与C a s p a s e8 ，C a s p a s e1 0 间的相互作用。c F L I P 不具有C a s p a s e8 的活性，故c F L l P 的过量表达能抑制F a s 介导的凋亡，从而促进肿瘤细胞过度生长。目前的肿瘤治疗方法或特异性差或疗效不好，均不能取得令人满意的结果。有研究应用反义核酸技术特异性抑制癌基因的表达，进而抑制肿癌细胞增殖。如蛋白激酶c 的反义化合物( I S I S 3 5 2 1 ) 已完成期
12、临床试验，可使卵巢癌患者的盆腔肿瘤块消退。而对于人F l i p 基因对肺癌的反义治疗国内尚未见报道。反义技术进行治疗肿瘤已成为研究的热点，经过特异修饰的O D N 如硫2 2 代磷酸修饰的O D N ，具有较强的抗核酶能力和膜通透性，可在一定程度进入细胞内，从基因翻译和转录等环节特异性阻断目的基因的表达。但将O D N 导入细胞中，存在着摄入量较低的问题。单纯增加O D N 的量，造成了O D N 的非特异性和毒副作用的增加。因此，本研究选择高效低毒的阳离子脂质体L i p o f e c t a m i n e r M 2 0 0 0 ，这种脂质体是目前应用较广范的包裹载体。实验结果证明了
13、脂质体在有效浓度范围内对细胞无毒性，且转染效率随时间和寡核苷酸量的增加而增加。本研究在体外经脂质体介导反义寡核苷酸c F L I P 转染人腺癌细胞系S P C A 一1 后，然后分别从对细胞生长的影响、对c F L I Pm R N A 和蛋白质表达的影响两个角度评价c F L I P 转染是否成功。首先，M T I “ 抑制实验表明随反义寡核苷酸浓度的增加，细胞生长显著受抑。转染后，逆转录P C R 和W e s t -e m 结果可见c F L I P 的m R N A 和蛋白质表达亦随浓度的增加而受到不同程度的抑制，但c F L I P 。蛋白下调显著，而c F L I P s 蛋白下
14、调不明显。可能的解释为反义寡核苷酸c F L I P 的靶标为e F L I P 的m R N A ，在转染后大部分的c F L I Pm K N A 被特异性封闭，从而抑制了其翻译过程，因此，随着反义寡核苷酸c F L I P 浓度的增加c F L I Pm R N A 和蛋白质表达抑制程度亦逐渐增加。另一方面，c F L I Pm R N A 被封闭使其蛋白质表达下降，从而使c F L I P 上D E D 对F A D D 上D E D 或C a s p a s e8 上D E D 的竞争性结合能力下降，结果使C a s p a s e8 参与的细胞凋亡过程得以进行而最终导致细胞凋亡。但
15、c F L I P 蛋白质的两个亚型中，c F L I P 。受影响较小。这可能是由于在S P C A一1 细胞系中，c F L I P 。的表达要高于c F L I P L ，因此反义寡核苷酸c F L I P 浓度增加对c F L I P 。的抑制作用较强；同时c F L I P 。的分子量较小，易于与D E D 结合，从而发挥主要作用，但在高浓度的反义寡核苷酸c F L I P 存在时，可能出现了位点结合的饱和性而表现为凋亡作用出现平台期，即凋亡程度不随浓度的增加而增强。这可以解释某些细胞对F a s 介导的凋亡不敏感的原因，提示应用靶向二者的O D N 效果可能会更好，但是其具体作用机
16、制有待于进一步实验研究。肺癌分子靶向治疗药物的研究已进入开发阶段，目前有众多的反义药物已进入临床实验阶段“。本研究证明了反义寡核苷酸c F L I P 转染人肺腺癌细胞系后，可抑制肿瘤细胞的生长，并诱导其凋亡，从而为肺癌的反义基因治疗提供可靠的实验依据。2 3 结论1 脂质体( L i p o f e c t a m i n e ) 介导的c F L I P 可成功的转染S P C A 一1 细胞。2 L i p o c F L I P A S O D N 能通过特异性封闭c F L I P 基因，降低c F L I P v s m R N A 和蛋白的表达。2 4 ，一一一一、 第二部分j、L 一，c F L I P 反义寡核苷酸对人肺腺癌S P C A l 细胞凋亡的研究雕昌W h y l l i e 和C u r r i e 于1 9 7 2 年首次提出了“细胞凋亡”这一概念，在经过对细胞凋亡现象的长期观察和分析后又阐明细胞凋亡是不同于
