《人β654型地中海贫血突变基因的克隆及其转基因小鼠的建立》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人β654型地中海贫血突变基因的克隆及其转基因小鼠的建立（69页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、作者：卢丽人B6 5 4 型地中海贫血突变基因的克隆及其转基因小鼠的建立专业：动物学 硕士生：卢丽 导师：黄冰副教授摘要地中海贫血( 以下简称地贫) 是一组具有高度异质性的遗传性疾病。其主要发病机制是由于珠蛋白基因座位突变，导致一种或多种珠蛋白肢链合成障碍，从而造成n 珠蛋白肽链和0 珠蛋白肽链间的合成失衡。B6 5 4 是广东省最常见的0 地贫类型之一，它是由于B 珠蛋白基因第二内含子第6 5 4 位核苷酸发生了C T 的点突变所致“1 。针对这种剪接缺陷性的基因突变，R N A 基因治疗已在非细胞体系和离体细胞系统中显现了它巨大的应用价值。但由于没有相应的转基因动物模型可供研究，R N A
2、 基因治疗在整体动物水平中能否取得与离体治疗同样的效果，及其在体内的安全性如何，疗效能够维持多长时间，这些问题至今未有文献报道。研究目的：克隆人p6 5 4 型地中海贫血突变基因；及建立携带人06 5 4 型地中海贫血突变基因且能稳定表达I N A 异常剪切的转基因小鼠，以支持6 5 4 型地中海贫血R N A 基因治疗在活体水平的研究。研究杰悖基：1 ) 人1 36 5 4 型地中海贫血突变基因的克隆与序列分析以B6 5 4 型地中海贫血纯合子患者基因组D N A 为模板，P C R 法扩增人B6 5 4 型地中海贫血突变基因( 产物命名为口6 5 4 ) 。P C R 产物克隆到p M D
3、1 8 一T作者：卢丽载体上并进行测序，验证其序列的正确性。将扩增得到的1 36 5 4 基因克隆至包含人BL C R 序列的基础质粒上，重组质粒经B c gI 酶切鉴定。2 1 人06 5 4 型地中海贫血突变基因转基因小鼠的建立重组质粒经毖钾V 酶切可获得长6 4 k b 的目的片段( 目的基因包括人1 3L C R 序列及人B6 5 4 基因) 。目的片段回收纯化后稀释至3 n g ul 用于显微注射。使用显微注射仪将外源D N A 注入小鼠受精卵雄原核内，经转基因操作后的受精卵移植至假孕母鼠体内继续发育。小鼠出生后用P C R 法初筛转基因小鼠，P C R 产物自动测序；R T P C
4、 R 法检测转基因小鼠体内外源基因的表达：最后，对转基因小鼠的外周血进行血红蛋白的分析，及观察转基因小鼠有无出现地中海贫血的症状。同时，将转基因小鼠与非转基因小鼠进行交配繁殖，获得的子代鼠用同样方法进行检测。研冤结果：人B6 5 4 型地中海贫血突变基因的P C R 扩增产物长度为3 3 1 4 b p ，测序结果经B L A S T 验证与基因库中序列一致，扩增产物包含了该突变基因第二内含子中的C T 点突变。引入06 5 4 基因后，重组质粒长约9 2 k b ，经却I 酶切鉴定，产生7 2 k b 和2 O k b 两种长度片段，说明t 36 5 4 基因与基础质粒中原有的人BL C R
5、 片段的方向相同。将目的片段以显微注射法导入昆明小鼠的受精卵，共注射小鼠受精卵2 1 9枚，得新生小鼠3 1 只，经P C R 初筛获得转基因小鼠2 只( 首建鼠) 。由2 只首建鼠繁殖获得子代小鼠1 0 7 只，得子代转基因小鼠6 只。P C R 产物测序结果表明转基因小鼠基因组中含有引入的C T 点突变。R T P C R 检测结果表明，部分转基因小鼠的外周血R N A 中含有长3 0 3 b p 的异常剪切片段；而在阴性对照鼠的外周血R N A 中，R T P C R 扩增后无产物；说明B6 5 4 基因已成功整合入转基因小鼠基因组并有转录。转基因小鼠血红蛋白的分析的结果表明：转基因小鼠
6、血红蛋白的类型、分布和总量与正常小鼠血红蛋白分析结果相似；未见明显改变。临床观察：转基因小鼠无明显的异常改变。后两点结果提示：转基因小鼠体内无异常的B 珠蛋白合成或合成量极低；即使有异常的1 3 珠蛋白合成，由于小鼠体内F 常血红蛋白的存在，也不足以引起临床病变。I T作者：卢丽结论：1 ) 成功克隆人B6 5 4 型地中海贫血突变基因2 ) 成功将人B6 5 4 型地中海贫血突变基因与BL C R 片段相连接，可用于显微注射；3 ) 人B6 5 4 型地中海贫血突变基因成功整合到小鼠基因组中，能遗传给后代小鼠，并在R N A 水平获得良好表达：4 ) 成功建立人B6 5 4 型地中海贫血突变
7、基因转基因小鼠，以支持B6 5 4 型地中海贫血D N A R N A 基因治疗在活体水平的研究：5 ) 由于小鼠体内存在F 常B 珠蛋白基因，所以即使转入的外源基因在R N A 水平获得表达，有可能产生病变的1 3 珠蛋白，亦无法使转基因小鼠呈现出地中海贫血典型的临床症状。6 ) 将人B 地中海贫血突变基因转基因小鼠与B 珠蛋白基因敲除小鼠杂交，可获得既携带人1 3 地中海贫血突变基因又具有表型的双转基因小鼠。我们所建立的人B6 5 4 型地中海贫血突变基因转基因小鼠，可用于下游双转基因小鼠的构建。关 乞词：地中海贫血，基因治疗，显微注射法，转基因小鼠【I 【作者：卢丽C l o n i n
8、 go ft h eh u m a nBt h a l a s s e m i am u t a n tg e n e ( B6 5 4 )a n de s t a b l i s h m e n to faB6 5 4t r a n s g e n i cm o u s eM a j o r ：Z o o l o g yN a m e ：L U US u p e r v i s o r ：A s s o c i a t eP r o f H u a n gb i nA b s t r a c tT h et h a l a s s e m i ai sah e t e r o g e n e
9、 o u sg r o u po fi n h e r i t e dd i s o r d e r s T h em a i np a t h o l o g i c a lm e c h a n i s mw h i c hc a u s e st h a l a s s e m i ai st h ei m b a l a n c ei nt h es y n t h e s i so fda n d1 3g l o b i nc h a i n s ，d u et om u t a t i o n si nt h eg l o b i nl o c i T h eC Tt r a n
10、s i t i o na tn u c l e o t i d e6 8 4o fi n t r o n2i nBg l o b i ng e n ei so n eo ft h em o s tf r e q u e n t1 3t h a l a s s e m i am u t a t i o ni nG u a n g D o n gC h i n a A n t i - s e n s eR N At h e r a p yf o rs p l i c em u t a t i o nh a sd i s p l a yo fi t sl a t e n ta p p l i c a
11、 t i o nV a l u ei nn o n - c e l ls y s t e m sa n di nc e l lc u l t u r eo n e s T h ea6 5 4t r a n s g e n i cm i c eh a v eb e e ne s t a b f i s h e dr e c e n t l yi nU S A N os u c ht r a n s g e n i ea n i m a lm o d e li sa v a i l a b l ei nC h i n ac u r r e n t l y W h e t h e ro rn o t
12、R N At h e r a p yo nt h ea n i m a ll e v e lc o u l dr e a c ha st h es a m ee f f i c i e n c y , s a f e t ya n dd u r a t i o na si th a sd o n ei nac e l lc u l t u r es y s t e m ?A b o u tt h e s eq u e s t i o n s ，n or e p o r te x i s t s 【o b j e c t i v e s 】I no r d e rt op r o v M eaa
13、 n i m a lm o d e lf o rt e s t i n gt h e r a p i e sf o rc o r r e c t i n gs p l i c i n gd e f e c t so f B6 5 4i nv i v o 。w ew a n tt oc l o n et h eh u m a nt h a l a s s e m i am o u n tg e n eB6 5 4 ，a n de s t a b l i s ha86 5 4t r a n s g e n i cm o u s em o d e l I V作者：卢丽 M e t h o d s l
14、1 C l o n i n ga n ds e q u e n c i n go ft h eh u m a nt h a l a s s e m i am u t a n tg e n eB6 5 4T h ei n t a c tB6 5 4g e n ew a sa m p l i f i e db yP C Rf r o mt h eD N Ao fah o m o z y g o u sB6 5 4p a t i e n tT h eB6 5 4g e n ew a sc l o n e di n t ot h ep M D1 8 - Tv e c t o rf o rs e q u
15、 e n c i n g T h e nt h eB6 5 4f r a g m e n tw a sc o h e s i v e - e n d c l o n e di n t ot h eb a s a lv e c t o rw h i c hc o n t a i n st h eBL C Rf r a g m e n t T h er e c o m b i n a n tp l a s m i dc o n s t r u c t e dW a Bv e r i f i e db ye n z y m e - d i g e s t i o n 2 E s t a b l i
16、s h m e n to ft h et r a n s g e n i cm o u s eo ft h eh u m a nt h a l a s s e m i am u t a n tg e n e B6 5 4T a r g e tg e n ef r a g m e n t sw e r el i b e r a t e df r o mt h e i rp l a s m i db a c k b o n e sb yd i g e s t i o nw i t hE c o RVT h eD N Af r a g m e n tf o ri n j e c t i o nW a sd i l u t e dt o3 n g ，t t1a f t e rp u r i f y D N Af r a g m e n tw a sm i c r o i n j e e t e di n t ot h em a l ep r o n u c l e u so ff e r t i l i z e de
