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1、口三鼻i = 1 习Kl I I I II II II Il l lI I II IlU I Y 1 8 9 3 4 2 1一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要7二、英文缩略语1 5三、论文论文一前言。1 6日H 舌O材料和方法1 7实验结果1 8讨论2 5结论2 6论文二前言2 ”H U 舌Z材料和方法2 9实验结果3 5讨论4 4结论4 6四、本研究创新性的自我评价4 7五、参考文献4 8六、附录综述5 2在学期间科研成绩6 3致谢6 4个人简介6 5中文论著摘要钙粘蛋白复合体成员在肺癌中的表达及调节机制研究刖昌E c a d h e r i n 是一种介导同质细胞问相互粘附的C a 2 +
2、 依赖性跨膜糖蛋白，主要分布于上皮组织中，其基因C D H l 定位于染色体1 6 q 2 2 1 ，c D N A 全长4 8k b ，在胞质内先合成1 3 5k D a 的蛋白前体，经剪切修饰成熟后转移至细胞膜发挥其生物学功能。E c a d h e r i n 的胞外区是由5 个串联重复的结构单元构成，每个结构单元大约含有1 1 0 个氨基酸残基，相邻的重复结构单元之问是C a 2 + 的结合位点，其中第一个重复序列( 最外侧) 包含一个“组氨酸丙氨酸缬氨酸”( H A V ) 三肽的模体，它决定着E c a d h e r i n 与同质细胞间的特异性识别和相互作用。跨膜区由3 2 个
3、氨基酸组成的疏水结构域。E c a d h e r i n 的胞内域含有S H l 和S H 2 区：S H l 区可以和p c a t e n i n ( 丫c a t e n i n ) 直接结合；S H 2 区和p 1 2 0 c t n 结合，发挥调节粘附分子二聚体聚集和解离的作用。目前的研究结果表明， I - c a t e n i n 和p 1 2 0 c a t e n i n 均为E c a d h e r i n 复合体的重要调节蛋白，可以通过调节E c a d h e r i n 复合体的稳定性，进而调节细胞细胞间的粘附。根据剪切部位的不同，p 1 2 0 c t n 可以
4、分为四种亚型，并且在哺乳动物的不同部位的正常组织及肿瘤组织内，p 1 2 0 c t n 所表达的亚型不同，具有组织特异性。目前的研究结果表明，p 1 2 0 c t n 在E c a d h e r i n 不同表达的情况下，会表现出截然不同的两种生物学作用，目前，对于p 1 2 0 c t n 各亚型在肺癌组织中的原位表达情况及p 1 2 0 c t n各亚型在E c a d h e r i n 存在或不完全缺失的状态下的作用的研究还未见到直接的报道。1 3 - c a t e n i n 既参D N E c a d h e r i n 复合体，又是W n t 信号通路中重要的信号传递子。
5、E c a d h e r i n 复合体与W n t 信号传导通路之间的相互作用，共同影响着肿瘤的发生发展。在肿瘤的发生发展过程中常伴有W n t 信号通路的异常激活；并且E C a d h e r i n 异常表达常与肿瘤细胞的低分化、高侵袭性、转移性相关。而在这一过程中B c a t e n i n起到桥梁作用。但是在肺癌中，究竟是E c a d h e r i n 复合体还是W n t 信号通路发挥更重要的作用，目前尚无定论。本研究旨在讨论p 1 2 0 _ q E 型1 在8 3 例肺鳞癌、腺癌中的表达及其与预后等各临床病理因素之问的关系，分析p 1 2 0 亚型1 的表达与，总p
6、1 2 0 c m 及E c a d h e r i n 表达之间的联系和区别。方法l 、肺癌组织8 3 例具有随访资料的原发性肺鳞癌、腺癌标本来自1 9 9 8 年2 月至2 0 0 0 年九月在中国医科大学第一附属医院行外科手术切除的标本。其中男4 9 例，女3 4 例。4 2 例新鲜肺癌组织来自中国医科大学附属第一临床学院2 0 0 8 2 0 0 9 年原发性肺癌患者外科手术切除标本。患者的生存期的计算是从手术日期到随访同期，或由于复发、转移而死亡的R 期为止。所有患者术前均未接受放化疗，术后常规化疗。8 3 例具有随访资料的标本均经4 中性甲醛固定，石蜡包埋，H E 常规染色后明确诊
7、断。4 2 例新鲜肺癌组织一部分标本在切下后5 分钟内取材并迅速置液氮中速冻，然后置于8 0 深冻冰箱保存备用，另一部分标本离体后用中性福尔马林固定。所有标本的使用均征得了患者本人同意，签订知情同意书。2 、免疫组织化学染色及结果判定S P 染色试剂盒及D A B 显色剂购自福州迈新生物技术公司。单克隆抗体p 1 2 0亚型1 ( 1 ：1 0 0 稀释，A b c a mC a m b r i d g eM A ，美国) ，p a n - p 1 2 0 c t n ( 1 ：4 0 0 稀释，B DT r a n s d u c t i o nL a b o r a t o r i e s
8、 ，美国) ，1 3 - c a t e n i n ( 1 ：4 0 0 稀释，B DT r a n s d u c t i o nL a b o r a t o r i e s ，美国) ，E c a d h e r i n ( 1 ：15 0 稀释，S a n t aC r u zB i o t e c h n o l o g y ，美国) 4 “ C孵育过夜。以正常支气管粘膜上皮细胞着色强度和定位为阳性对照，P B S 缓冲液代替一抗为阴性对照。每张切片随机选取5 个高倍视野，每高倍视野计数1 0 0 个瘤细胞，无着色为( 一) ，总p l2 0 c t n 、1 3 - c a t
9、e n i n 和E c a d h e r i n ：膜着色清楚、连续且阳性细胞数9 0 定义为正常表达；膜表达减弱、消失和或细胞浆核中出现1 0 的阳性表达均视为异常表达；p 1 2 0 亚型1 ：细胞浆中表达 1 0 贝J J 为异常表达。3 、细胞培养和5 - a z a d C 处理2人肺巨细胞癌P G 亚系B E I 细胞由北京医科大学惠赠，其余肺癌细胞系购自中科院上海细胞所。细胞系培养于含1 0 胎牛血清，2 3 9 LN a H C 0 3 、l O O U m l青链霉素的R P M I1 6 4 0 培养液中，每2 天用0 2 5 胰酶消化传代。5 - a z a d C
10、直接加入培养基，终浓度7 1 x m o l L ，每天换液加药，继续培养4 8 小时。4 、细胞免疫荧光染色细胞爬片后，4 多聚甲醛室温固定，0 2 T r i t o nX 一1 0 0 处理1 5 分钟，l B S A封闭3 0 分钟，滴加鼠抗人单克隆a n t i p c a t e n i n 抗体和a n t i E c a d h e r i n 抗体，4 “ C孵育过夜，滴加T R I T C 标记羊抗鼠荧光标记二抗，稀释比例为l ：1 0 0 ，3 7 孵育l小时，D A P I 核复染。荧光显微镜观察荧光信号，C o o l P I X5 4 0 0 照相机拍摄荧光图片。5
11、 、R T P C R采用T r i z o l 试剂提取肺癌组织或培养细胞的总R N A ，利用R N AP C RK i t ( A M V )V e r 3 0 试剂盒进行反转录。以1 3 - a c t i n 为内参，1 3 - c a t e n i n 的P C R 扩增产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳后，成像分析。6 、W e s t e r nB l o t将含8 0 p g 总蛋白的裂解产物进行S D S P A G E 电泳后，转印至P V D F 膜，单克隆抗体1 3 - c a t e n i n4 “ C 孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗3 7 。C 孵育2 小时后D
12、A B或E C L 显色。7 、甲基化特异性P C R提取组织和细胞基因组D N A ，采用E ZD N A 甲基化试剂盒一G o l d ( 北京天漠) ，按照试剂盒说明书操作对基因组D N A 进行甲基化转变。取甲基化产物利用甲基化引物和非甲基化引物进行P C R 扩增，P C R 扩增产物使用1 5 琼脂糖，1 2 0 V 电泳3 0 m i n ，E B 染色，凝胶成像系统下观察。8 、四甲基偶氮唑盐( t e t r a z o l i u m ，M T T ) 法检测细胞增殖能力取对数生长期的肺癌细胞悬液( 细胞密度3 x 1 0 5 个m 1 ) 分别接种于4 个9 6孔板培养板
13、，每板分6 组：空白组( A ) ( B ) ，干扰对照组( C ) 、干扰组( D ) 、3抗体抑制对照组( E ) 和抗体移植组( F ) 。培养第2 4 、4 8 、7 2 小时分别加入M 1 v r( 5 m g m 1 ) 2 0 1 ，继续孵育4 小时后，每孔加入1 5 0 1 x l D M S O 溶解结晶，选择波长4 9 0 n m ，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度。实验重复5 次。绘制细胞生长曲线。9 、体外基质胶侵袭实验( T r a n s w e l l ) 检测细胞侵袭能力按照B D 公司说明操作，取1 0 0 p 1 细胞j 悬液( 5 x 1 0 6 个m 1
14、 ) 滴入上室内，下室加入含有1 0 胎牛血清的R P M I1 6 4 0 培养液，上下室之间用孔径为8 p m 的聚碳酸酯微孔滤膜分开，将小室置3 7 * ( 2 ，5 C 0 2 条件下放置后，弃去上室内液体，擦尽膜上M a t r i g e l 胶，1 0 0 甲醇固定3 0 分钟，常规苏木素染色，光镜下计数细胞数。1O 、统计分析应用f 和F i s h e r 检验对蛋白表达与组织学特征以及临床指标间的关系进行统计学处理。所有统计学处理均采用S P S S 软件系统S P S Sf o rW i n d o w s1 3 0 进行统计学分析。结果1 、p 1 2 0 亚型l 与总p 1 2 0 c t n 和E c a d h e r i n 的表达模式不同，p 1 2 0亚型1 的过表达总是与总p 1 2 0 c t n 的异常表达一致，并与E 。c a d h e r i n的表达相关免疫组化染色表明：在正常支气管上皮细胞中。总, p 1 2 0 c t n 和E c a d h e r
