《穿膜肽携带的目的蛋白穿膜效应的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《穿膜肽携带的目的蛋白穿膜效应的研究（112页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、缩写词 K 瓣b pB S AC d kC K I sC P P sD aE CEc o l iE D T AE G F PF B SF C MH T CG F PVI g口T GK bK i pM A bM C So D 2 6 0O n主要缩写词英文全称a n t e n n a p e d i ah o m o d o m a i nb a s ep a i rf e t a lb o v i n ea l b u m i nc y c l i nd e p e n d e n tk i n a s ec y c l i nd e p e n d e n tk i n a s ei n
2、h i b i t o rc e l l - p e n e t r a t i n gp e p a a e sd a l t o ne s o p h a g e a lc a r c i n o m ac e l lE s c h e r i c h i ac o l ie t h y l e r i ed i a m i n e t e w a a c e t i ca c i de n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i nf e t a lb o v i n es e n l mf l o wc y t o
3、m e t r yf l u o r e s e e i ni s o t h i o c y a n a t eg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i nh u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u si m m u n o g l o b u l i ni s o p r o p y lt h i o - 1 3 - D - g a l a c t o s i d ek i l o - b a s eK i n a s ei n h i b i t i o np r o t e i nm o
4、n o c l o n a la n t i b o d ym o n o e l o n a ls i t e so p t i c a ld e n s i t ya t2 6 0 n mo r g i no f r e l i c a t i o n1中文全称果蝇触角同源异形域碱基对牛血清白蛋白周期素依赖激酶周期素依赖激酶抑制剂细胞穿膜肽道尔顿食管癌细胞埃希氏大肠杆菌乙二胺四乙酸增强型绿色荧光蛋白胎牛血清流式细胞术异硫氰酸荧光素绿色荧光蛋白人类免疫缺陷病毒免疫球蛋白异丙基硫代1 3 D 一半乳糖苷千碱基对激酶抑制蛋白单克隆抗体单克隆酶切位点吸光度复制起始点P A G EP B SP C
5、RP E GP T Dr m i nS D SS O D西fT r i sV E G Fp o l y c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i sp h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o np o l y e t h y l e n eg l y c o lp r o t e i nt r a n s d u c t i o nd o m a i nr o u n dp e rm i n u t es o
6、d i u n ld o d e c y ls u l f a t es u p e r o x i d ed i s m u t a s eT r a n s - a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r2 - a m i n o - 2 - ( h y d r o x y m e t h y l ) - 1 ，3 p r o p a n e d i o lv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r2聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲溶
7、液聚合酶链式反应聚乙二醇蛋白转导域转分钟十二烷基硫酸钠超氧化物歧化酶反式转录激活因子2 - 氨基- 2 掘甲基一1 ，3 丙二醇血管内皮生长因子中文摘要生物大分子在许多疾病的治疗中发挥着重要作用，如超氧化物岐化酶( S O D ) 和过氧化物酶( C A T ) 、V E G F 、糖尿病特效药胰岛素、抑癌基因表达的抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞凋亡的抑瘤蛋白p 5 3 、p 2 7 等。由于细胞膜的天然屏障作用，只有分子量小于6 0 0 D a 的小分子化合物、非极性疏水性的、脂溶性的，或细胞膜上有其载体的有机物才能穿透细胞膜进入细胞内。使得这类有治疗价值但无细胞膜穿透性且易降解的亲水性分子
8、在细胞生物学、药学等研究领域中的应用大大受到限制。多年来，研究人员致力于探索将这些效应分子导入活细胞的有效方法。常用的方法有电穿孔、显微注射、改变大分子物质的物理和化学性状、基因转染、颗粒( 如脂质体) 包裹法和细胞融合技术等。尽管这些方法各有优势，但都存在着操作复杂、效率不高和难于调控等问题。近年来，相继发现了一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度为几个至几十个氨基酸不等，多数小于2 0 个氨基酸，被命名细胞穿膜肽( c e l l - p e n e t r a t i n gp e p t i d e s ，C P P s ) 。细胞穿膜肽也被称之为蛋白转导域( p r o t e i
9、n 仃a n s d u c f i o nd o m a i n , P T D ) ，或T r o j a nh o r s ep e p t i d e s ，可以有效地将蛋白、多肽、核酸片段通过无受体介导、无耗能的方式，导入多种哺乳动物细胞，且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。C P P s 的发现为生物大分子用于疾病治疗带来了曙光，在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景。细胞穿膜肽有天然存在和人工合成两大类，细胞穿膜肽的研究始于1 9 8 8 年，G r e e n 和F r a n k e l 分别证实H I V 一1 的反式激
10、活蛋白T a t 能跨膜转移入细胞质和细胞核内。1 9 9 7 年，V i v e s等发现H I V T A T 中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片断与蛋白转导功能密切相关天然存在的C P P s 。目前已经发现的有三种，分别来自果蝇同源异型域A N T P 、单纯疱疹病毒l 型( H S V - 1 ) V P 2 2 转录因子以及H I v - l 和S I V ( 2 ，3 ) 的T a t 。这些细胞穿膜肽均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基。利用这一特性，人工合成的多聚精氨酸、赖氨酸，也具有穿膜活性，且9 个精氨酸和9 个赖氨酸残基构成的基
11、序比T a tP T D 的蛋白转导活性还要强。经过对天然存在的C P P s 的结构研究M o r r i s 小组设计合成了2 1 个氨基酸残基的兼性肽段P E P 1 ( K E n v w E T w W T E W S Q P V ) ，P E P 一1 不同于天然C P P s ，无需共价键与目的大分子相连即可发挥转运外源大分子的作用，可以转运天然构像蛋白高效进入细胞，这大大改善了以往的C P P s 只能高效转运变性蛋白的缺憾。绿色荧光蛋白( G r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，G F P ) 由2 3 8 个氨基酸组成，
12、分子量为2 7 k D ，在3 9 5 n m 波长光的激发下可以发射出明亮的绿色荧光，它的表达没有种属特异性，不需要辅助因子、底物或其他基因表达产物的协助，灵敏度高。在多数细胞G F P 发出的荧光可以均匀地充满胞浆、细胞核和诸如轴突的远端突起。G F P 在活细胞、组织或器官中无需任何处理即可在荧光显微镜下直接观察，加之动物体内不产生内源性G F P ，它是活细胞的理想标记物，可以在荧光显微镜下直接对活体细胞进行研究。由于其荧光稳定、检测方便、对活细胞无伤害等，己被作为报告蛋白在检测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面被广泛应用。增强型绿色荧光蛋白( E n h a n
13、 c e dg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，E G F P ) 是G F P 的突变体，是由G F P 的第6 4 、6 5 位的苯丙氨酸和丝氨酸分别置换成亮氨酸和苏氨酸而形成四J ，E G F P 在4 8 0 n m 波长的激发下可以发射出比G F P 亮3 5 倍的绿色荧光，使得其观察和检测更为方便灵敏。p 2 7 基因是= P o l y a k 等于1 9 9 4 年发现的种抑癌基因，其在肿瘤发生发展和治疗方面的作用正不断被发现。正常情况下p 2 7 基因在G O G l 期表达增高，当细胞进入S 期表达下降。p 2 7
14、基因编码的P 2 7 蛋白是细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子( C V - d s ) ，是细胞周期的负调控因子，能作用于整个细胞周期，广泛抑制各种细胞周期素和C D K 的活性，具有负调控细胞周期进程、参与细胞分化的调控、诱导细胞凋亡等作用。除此之外P 2 7 还可调节实体瘤的耐药性，防止炎症对机体的损伤。P 2 7被广泛应用于各种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等治疗的试验研究，P 2 7 的降解主要由泛素介导的1 8 7 位苏氨酸磷酸化引起，半衰期较短( 约2 h ) ，在体内不稳定，因j l t p 2 7 k i p l 被称为“短寿蛋白”。K u d o 等研究发现将1 8 7
15、位的苏氨酸置换成丙氨酸，p 2 7 蛋白将不被泛素激活，蛋白降解明显降低【3 I 】。J e a n 等将p 2 7 转染H e y C 2 细胞，发现细胞生长明显抑制。本研究使用的p 2 7 m t 是将天然存在的p 2 7 ( 也称野生型p 2 7 w t ) 编码1 8 7 位苏氨酸和1 8 8 位脯氨酸的e D N A 序列A C G C C C 突变为A T G A I ，翻译的氨基酸相应的置换成蛋氨酸和异亮氨酸，突变后的P 2 7 m t 因失去1 8 7 位苏氨酸活性基团羟基而不能被磷酸化，半衰期延长，能更紧密的结合C D K c y c l i n 复合物，预示P 2 7 m
16、t 具有更强的抑癌作用。作为一个含1 9 8 个氨基酸2 7 K D 大小的蛋白质，P 2 7 m t 很难穿透脂质双分子的细胞膜并在细胞内达到一定的浓度。本课题分为三个部分第一部分：T A T - E G F P 融合蛋白对小鼠生物膜穿透性的研究人工合成编码H I V T A TP T D1 1 个氨基酸的双链寡核苷酸片段，P C R 扩增目的基因E G F P ，分子克隆常规操作构建p E T 2 8 a - T A T E G F P重组表达载体，转导入宿主菌B L 2 1 后用I P T G 诱导T A T E G F P 融合蛋白表达，经镍金属鳌合层析柱纯化获得融合蛋白。通过腹腔注射到小鼠体内，观察T A T E G F P 融合蛋白穿透各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。研究发现腹腔注射T A T E G F P ，3 0 m i n 后各主要脏器经检测均有荧光出现，4 h 各组织荧光强度达最大值。研究证明H I V - 1T A T P T D 与E G F P 形成的融合蛋白可穿透包括脑组织在内的所有生物膜。这一结果为T
