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1、5.4.4 定点突变技术 （site-directed mutagenesis）5.4.4 定点突变技术 （site-directed mutagenesis）Introduce specific Point Mutations (single base changes) into Cloned Gene. 目的：目的： 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码 的氨基酸序列。通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码 的氨基酸序列。 应用：应用： 研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催 化活性以及结合配体能力的影响，研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催 化活性以及结合配体能力的影
2、响， 改造DNA调控元件特征序列，改造DNA调控元件特征序列， 修饰表达载体，修饰表达载体， 引入新的酶切位点等。引入新的酶切位点等。诱变寡核苷酸引物诱变寡核苷酸引物含单拷贝野生型靶序列的 单链重组含单拷贝野生型靶序列的 单链重组M13DNA应用应用DNA聚合酶延伸诱 变寡核苷酸引物聚合酶延伸诱 变寡核苷酸引物转染大肠杆菌，筛选携 带突变体克隆的转染大肠杆菌，筛选携 带突变体克隆的M13噬 菌斑噬 菌斑纯化待筛克隆，序列分 析验证突变体纯化待筛克隆，序列分 析验证突变体AGGCGGCTACGTGGCCTAAGGCGGCTAGGTGGCCTA寡核苷酸介导的DNA突变技术模板模板DNAFMR M5
3、 5 5 5 55 55 55 3 3 3 3 333 3 33 5 533124引物变性和退火引物变性和退火35 533F 2R 25 5 335 5335 533R2F 2重叠延伸介导的定点 诱变模板DNA分别和引物对1 （正向诱变引物FM和反 向引物R1）与引物对2 （正向引物F2和反向诱 变引物RM）退火，通过 PCR1和2反应扩增出两种 靶基因片段。在PCR3反应中变性后的 FMR2和RMF2片段在重叠 区发生退火，按虚线所 示进行延伸，并形成全 长双链DNA。PCR4使用引物F2和R2扩 增出全长突变DNA。重叠延伸介导的定点 诱变模板DNA分别和引物对1 （正向诱变引物FM和反
4、向引物R1）与引物对2 （正向引物F2和反向诱 变引物RM）退火，通过 PCR1和2反应扩增出两种 靶基因片段。在PCR3反应中变性后的 FMR2和RMF2片段在重叠 区发生退火，按虚线所 示进行延伸，并形成全 长双链DNA。PCR4使用引物F2和R2扩 增出全长突变DNA。PCR介导的定点突变优点：1、突变体回收率高，以至于有时不需要进行突变 体筛选；2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位点引入突 变；3、可在同一试管中完成所有反应；4、快速简便，无需在噬菌体M13载体上进行分子克 隆。PCR介导的定点突变优点：1、突变体回收率高，以至于有时不需要进行突变 体筛选；2、能用双链DNA作为模
5、板，可以在任何位点引入突 变；3、可在同一试管中完成所有反应；4、快速简便，无需在噬菌体M13载体上进行分子克 隆。除DNA序列分析之外，也可用变性梯 度凝胶电泳和单链构象多态性等方法检 测产生突变的DNA片段。除DNA序列分析之外，也可用变性梯 度凝胶电泳和单链构象多态性等方法检 测产生突变的DNA片段。5.4.5 RNA干涉技术 （RNA interference，RNAi）5.4.5 RNA干涉技术 （RNA interference，RNAi）利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内 同源mRNA或阻遏mRNA翻译为蛋白质 ，从而阻 断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失 的表型。利用双
6、链小RNA高效、特异性降解细胞内 同源mRNA或阻遏mRNA翻译为蛋白质 ，从而阻 断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失 的表型。 1998年，科学家首次发现双链RNA被摄入细 胞后，可特异性高效率抑制与其同源的靶 基因表达，他们将这一现象命名为RNA interference（RNAi）。1998年，科学家首次发现双链RNA被摄入细 胞后，可特异性高效率抑制与其同源的靶 基因表达，他们将这一现象命名为RNA interference（RNAi）。 至今已在果蝇、锥虫、涡虫、线虫等许多 动物及大部分植物中陆续发现了RNAi效 应。至今已在果蝇、锥虫、涡虫、线虫等许多 动物及大部分植物中陆续发
7、现了RNAi效 应。 RNAi的主要特点：的主要特点： siRNAs (small interfering RNAs) 是一种是一种 2125 nt的的dsRNAs； 沉默特异序列的基因沉默特异序列的基因. 可由可由RNA-dependent 依赖的依赖的RNA 聚合酶产 生信号扩增聚合酶产 生信号扩增 . 广泛存在于 真核生物中广泛存在于 真核生物中. Germ-line inheritable。RNAi作用机制图解非哺乳动物细胞和哺乳动物细胞的区别：非哺乳动物细胞和哺乳动物细胞的区别：非哺乳动物细胞可以利用较长的双链RNA直接 诱导RNAi而无须合成siRNA，因此，设计非哺乳动 物细胞R
8、NAi实验的步骤比较简便。只要通过目的基 因体外转录得到所需要的dsRNA，再通过浸泡、注 射或转染靶细胞即可实现RNAi。哺乳动物细胞内，较长的dsRNA（多于29个核 苷酸）会导致非特异性基因沉默，只有大约21个核 苷酸的siRNA才能有效引发特异性基因沉默。非哺乳动物细胞可以利用较长的双链RNA直接 诱导RNAi而无须合成siRNA，因此，设计非哺乳动 物细胞RNAi实验的步骤比较简便。只要通过目的基 因体外转录得到所需要的dsRNA，再通过浸泡、注 射或转染靶细胞即可实现RNAi。哺乳动物细胞内，较长的dsRNA（多于29个核 苷酸）会导致非特异性基因沉默，只有大约21个核 苷酸的si
9、RNA才能有效引发特异性基因沉默。将dsRNA 导入细胞沉默目的基因的表达将dsRNA 导入细胞沉默目的基因的表达 a, A silencing signal moves from the veins into leaf tissue. Green is GFP fluorescence and red is chlorophyll fluorescence that is seen upon silencing of the GFP transgene. b, C. elegans engineered to express GFP in nuclei. Animals on the rig
10、ht have been treated with a control dsRNA, whereas those on the left have been exposed to GFP dsRNA. c, HeLa cells treated with an ORC6 siRNA and stained for tubulin (green) and DNA (red). Depletion of ORC6 results in accumulation of multinucleated cells. d, Adult Drosophilaexpress a hairpin homolog
11、ous to the white gene (left), which results in unpigmented eyes compared with wild type (right).用途：基因功能研究基因治疗及药物筛选用途：基因功能研究基因治疗及药物筛选5.5 基因芯片及数据分析5.5 基因芯片及数据分析 基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列 （DNA microarray）基因芯片（DNA chip），又称DNA微阵列 （DNA microarray） 诞生的基础：诞生的基础： 功能基因组学研究的不断深入，迫切需要能同 时监测大量靶基因表达的实验手段，迅速准确 地在基因组
12、水平上阐述不同生物组织或细胞中 各种转录本的变化规律。功能基因组学研究的不断深入，迫切需要能同 时监测大量靶基因表达的实验手段，迅速准确 地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中 各种转录本的变化规律。基因芯片制作基因芯片制作 机械臂把大量已知或未知序列的DNA片段点 在一张很小的玻璃片（通常为22厘米2） 或尼龙膜上，再经过物理吸附作用达到固 定化（cDNA芯片）。机械臂把大量已知或未知序列的DNA片段点 在一张很小的玻璃片（通常为22厘米2） 或尼龙膜上，再经过物理吸附作用达到固 定化（cDNA芯片）。 直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得 到寡聚核苷酸芯片。直接在玻璃板表面进行化学合成，
13、从而得 到寡聚核苷酸芯片。基因芯片杂交将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交， 经过计算机扫描和数据处理，便可以观察 到成千上万个基因在不同组织或同一组织 不同发育时期或不同生理条件下的表达调 控情况。基因芯片杂交将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交， 经过计算机扫描和数据处理，便可以观察 到成千上万个基因在不同组织或同一组织 不同发育时期或不同生理条件下的表达调 控情况。微阵列芯片制作的主要过程如下：1经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段； 2用机械手将PCR产物点在玻璃板上，变性、固 定； 3分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成 cDNA； 4分别用cy3（绿色）和cy5
14、（红色）两种荧光染料 标记两种cDNA； 5将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交； 6激光扫描芯片杂交结果，计算机处理； 7分析杂交数据。微阵列芯片制作的主要过程如下：1经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段； 2用机械手将PCR产物点在玻璃板上，变性、固 定； 3分别从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成 cDNA； 4分别用cy3（绿色）和cy5（红色）两种荧光染料 标记两种cDNA； 5将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交； 6激光扫描芯片杂交结果，计算机处理； 7分析杂交数据。棉花胚珠总RNAmRNA逆转录大规模PCR扩增机械手臂点样Cy5（红色） 标记Cy3（绿色） 标记
15、杂交反应激光扫描二次组合成像计算机成像数据分析红色：纤维中高表达 黄色：表达水平不变 绿色：胚珠中高表达Cy3Cy5棉花纤维待研究棉花基因 1.纤维特异基因 2.胚珠特异基因 3.看家基因利用基因芯片研究棉花基因在纤维组织中的受调控情况棉花基因芯片杂交结果图 暗色点（原图为红色）代表在纤维中高表达的基因，亮色点（原图为绿 色）代表在胚珠中高表达的基因。需要进行重复试验以确保数据的准确。主要的方法是通过两次平行杂交反应，将 每个基因在两个反应中的表达水平做成对应散点图，只要绝大多数基因的杂交结 果都在45度斜线附近，就说明实验结果是可靠的-2 -1 0 1 2210-1-2Log2（Cy3/cy
16、5） XLog2?Cy5/cy3?Y微珠芯片技术（微珠芯片技术（BeadArray） 微珠芯片技术是在光导纤维技术上发展起来的技 术，用途主要集中在SNP及基因型分析、基因表达 谱分析和蛋白组学研究三大领域微珠芯片技术是在光导纤维技术上发展起来的技 术，用途主要集中在SNP及基因型分析、基因表达 谱分析和蛋白组学研究三大领域 在直径为3.5mm的光纤束中，包含约50000根光 纤。在每根光纤的顶部蚀刻出一个小洞，可镶嵌 直径为3um的微磁珠。每个微磁珠上可以根据不同 的要求连接不同的配体，如寡核苷酸、蛋白、抗 体等在直径为3.5mm的光纤束中，包含约50000根光 纤。在每根光纤的顶部蚀刻出一个小洞，可镶嵌 直径为3um的微磁珠。每个微磁珠上可以根据不同 的要求连接不同的配体，如寡核苷酸、蛋白、抗 体等 将带有所需配体的不同微珠混合后与光纤束进行 自组装，通过微珠上
