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1、湖北中医学院博士学位论文针灸预处理对老年性痴呆模型大鼠Wnt信号转导通路影响的实验 研究姓名：周华申请学位级别：博士专业：针灸推拿学指导教师：孙国杰20090530中文摘要目的建立A D 大鼠模型，探讨针灸预处理对老年性痴呆模型大鼠W n t 。信号转导通路的影响，揭示针灸防治A D 的机制。方法在大鼠双侧海马区注射A B ：，喇，建立A D 大鼠模型，分别随机分为正常组、假手术组、模型组、预艾灸组、预电针组、预电针加灸组，一共6组，每组各2 0 只。通过预电针和预艾灸大鼠的百会和肾俞穴2 8 天后，观察各组大鼠w n t 信号转导相关指标的变化。通过M o r r i s 水迷宫检测行为学，
2、免疫组化和免疫印迹检测大鼠海马组织轴蛋白和B 一连环蛋白，通过酶联免疫法检测蛋白质磷酸酶2 A 和糖原合酶激酶- 3 1 3 的活性，通过实时定量P C R 技术检测W n t l 基因表达，并通过超微电镜观察海马组织超微病理变化。结果1 水迷宫检测行为学发现模型组大鼠学 - - j 记忆能力有明显损害，其平均潜伏期、经过中心区域的比例、平均游过的路径距离与正常组和假手术组有显著差异( P 0 0 5 从表1 可以看出，从前5 天平均潜伏期、经过中心区域的比例、平均游过的路径距离等指标来看，模型组与正常组和假手术组比较均有显著性差异( P 0 0 5 ) I I 证实电针法和灸法对于预防和改善
3、A D 大鼠记忆功能差别不大。针灸预处理对老年性痴果模型大鼠W n t 信号转导通路影响的实验研究 仄、 j 目 一。- 、，模型组( 第四天)弋b0 0 5 。从表2 可以看出，从经过平台所在区的次数、经过中心区域的比例等指标来看，模型组与正常组和假手术组比较均有显著性差异( P O 0 5 ) ，证实针法和灸法对于改善A D 大鼠记忆功能没有明显差异。 卜以 S? 岁、忒彦k沙模型组( 第六天)预电针组( 第六天)针灸预处理时老年性痴呆模型大鼠W r i t 信号转导通路影响的实验研究僳0 0 5 无显著性差异。所有数据均输入计算机，以S P S S l 3 0 0 软件统计包处理。3 实
4、验结果及分析3 1 免疫组化结果湖北中医学院2 0 0 6 级针灸骨伤学院 蒺预艾是组x 4 0 0预电针加是组x 4 0 0困I 各组大鼠海马齿状回区A x i n 的袁达从圉l 可以看出，正常纽和假手术组阳性A x m 蛋白表达较少，锥体细胞形态规则，胞核、胞质清晰，胞核大而圆，呈均匀淡蓝色或蓝色，核仁清晰，细胞质丰富，而模型组阳性A x i n 蛋白表达较多，呈棕黄色颗粒，胞内、核膜及胞膜上均有表达，预电针、预艾灸组和与电针加灸组得到明显改善。鬻藕* A 目 B # 模女鼠w n t 口号# 导日路影自的女验目竞预艾爱组4 0 0顸电针加灸组x 4 0 0图2 备组大鼠海马齿状回区B C
5、 a t e n i n 的表达从图2 可以看出，正常组和假手术组阳性蛋白表达较多，呈棕黄色颗粒，主要位于胞浆内，核膜及胞膜上也有表达。而模型组阳性1 3 - C a t e n i n表达明显减少，锥体呈均匀淡蓝色或蓝色，预电针和预艾灸治疗后各组大鼠海马锥体细胞形态和数量更接近于假手术组和正常组。湖北中学院2 0 0 6 级针灸骨伤学院3 2 免疫印逮结果2345B - a c t i n胁c t i n泳道圈3 备组大鼠W e s t e r nb l o t t i n g 检测A x i n ，I I - C a t e n i n 表达注：I 代表正常组、2 代表假手术组、3 代表模
6、型组、4 代表预艾灸组、5 代表预电针 组，6 代表预电针加受组。表1 各组大鼠A x i n 、 I - C a t e n i n 表达坌望型塾! 型!竺! 业兰! ! 竺! ：! ! 竺! 型兰! ! 坚 正常蛆80 1 0 8 = 0 0 506 5 4 i 9 0 3板手术组模型组预电针组预芰灸组预电针加灸组O5 8 5 = 00 2 0 3 9 0 i 0 0 6 0 4 5 4 0 0 8 0 4 0 0 7 03 3 8 0 0 701 9 7 ：0 0 5 * 0 4 3 7 士0 O4 6 3 士00 9 6 0 4 8 l 2 5 注：与正常组和假手术组比较，“ k p
7、0 0 5 ；与预电针组比较，t r p 0 0 5 。针灸预处理对老年性痴呆模型大鼠W n t 信号转导通路影响的实验研究图4 各组大鼠W e s t e r nb l o t t i n g 检测A x i n 表达1 代表正常组、2 代表假手术组、3 代表模型组、4 代表预艾灸组、5 代表预电针组、6 代表预电针加灸组。图5 各组大鼠W e s t e r nb l o t t i n g 检测l I - C a t e n i n 表达1 代表正常组、2 代表假手术组、3 代表模型组、4 代表预艾灸组、5 代表预电针组、6 代表预电针加灸组。从表1 和图3 、图4 、图5 可以看出，正
8、常组大鼠海马组织A x i n 表达较少，而f I - C a t e n i n 表达较多，I 模型组大鼠A x i n 表达显著增加，- 9 正常组和假手术组比较有极显著性差异( P O 0 5o湖北中医学院2 0 0 6 级针灸骨伤学院3 3 检测技术和方法的选择免疫组化法( s t r e p ta v i d i n b i o t i nc o m p l e x ，S A B C ) 是指酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对相应的抗原进行定性、定位和定量测定的一项技术。S A B C 免疫组化法是较传统的检测方法，由于其操作简便，不需要贵重仪器
9、的优点，因此是目前国内外常用的检测方法。但其敏感性和特异性较低，常出现假阴性和假阳性结果，并且其分析存在较大主观性，不能进行准确定量分析，此方法在应用上受到一定的限制。免疫印迹法( i m m u n ob l o t t i n gt e s t ，I B T ) 又称酶联免疫电转移印斑法，亦被称为W e s t e r n b l o t 。免疫印迹是将凝胶电泳的高分辨力和免疫化学检测的特异性融为一体。免疫印迹技术是把电泳分离的蛋白质组分从凝胶转移到一种固相支持体，通过抗体与附着与固相支持物的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应来进行检测的。免疫印迹利用抗原抗体的特异反应，排除了其它蛋白质
10、的干扰，它的灵敏度可以达到标准的固相放射免疫分析的水平，但无需对蛋白质进行放射性标记，是一个有效的分析手段，广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性。具有高效、简便、灵敏等特点。但W e s t e m b l o t 法也有一些难以解决的缺点，它一般只用于定性研究，难以定量。此外，虽然一些蛋白质分子量不同，但由于其带电荷相同，在电场中泳动速度仍可相同，从而使不同分子量的蛋白质出现电泳距离一致的条带，容易造成混淆。另一方面，W e s t e r n b l o t 法中的抗原是经过变性的，即使有些抗体可能识别转移膜上的变性抗原决定簇，但并非所有抗体均能与变性抗原决定簇反映，故W e s t e r
11、 n b l o t 法并非高度敏感。3 4 A x i n 和B C a t e n i n 与A D 的关系轴蛋白( A x i n ) 是1 9 9 7 年从一种称为F u s e d 的小鼠突变株中克隆到的基因【2 0 1 。A x i n 是一个体轴发育抑制因子，作为构架蛋白在W n t 信号转导途径中起着关键的作用。A x i n 通过W n t 信号转导途径参与了体轴发育、细胞死亡、神经元的分化等一系列生物学效应的调控1 2 1 1 。A x i n 作为W n t 通路的抑制因子，通过与A _ P C 、G S K 一3 8 、8 - c a t e n i n 结合形成复合体
12、促进针灸预处理对老年性痴采模型大鼠W n t 信号转导通路影响的实验研究B - c a t e n i n 的降解，调节B - c a t e n i n 的磷酸化和稳定性，还可以负向调节G S K - 3 B 对t a u 蛋白的磷酸化，同时含有蛋白磷酸酶2 A ( P P 2 A ) 结合位点的A x i n 还可通过提高P P 2 A 的活性【捌，从而阻止A D 中神经纤维缠结的形成。在未受W n t 信号刺激的细胞中，细胞内的B - c a t e n i n 信号发送行为通过丝氨酸苏氨酸，被控制在很低的水平并伴随着普遍存在和快速降解。W n t 信号的刺激抑制了在胞质和胞核中累积的B
13、 - c a t e n i n 的磷酸化，在此过程中，A x i n 是一种必不可少的负性调节因子。A x i n 的作用就是吸收这条途径的大部分的组分，通过将G S K 3 B 和底物B - c a t e n i n 相结合，A x i n促进了B c a t e n i n 磷酸化的专一性和高效性。A P C 是B - c a t e n i n 降解循环中重要的组成蛋白，A x i n 可以调节B - c a t e n i n 与A P C 的结合。而A P C - A x i n复合体可调节G S K 3 B 的活性，并且G S K 3 B 催化B - c a t e n i n
14、 的作用还必须在A x i n 结合位点的参与下进行【矧。突变的A P C 不能与A x i n 结合，则导致了w r i t 通路的异常活化【矧。B c a t e n i n 作为一种黏附分子于1 9 8 0 年由德国细胞生物学家W a l tB i r c h m e i e r 首先发现。它是w n t 信号通路的核心分子，在W n t 信号通路中扮演了重要角色。在正常组织细胞中，胞浆内B - c a t e n i n 大部分与E 钙黏蛋白形成复合物，从而保持胞质内B - c a t e n i n 浓度处于相对较低的状态，形成一个类似拐杖的结构介导细胞间的黏附【2 5 1 。B 连
15、环蛋白分子在细胞质内聚集，并与转录因子T C F L E F 结合形成转录复合物转运入核，启动下游靶基因的转录和表达，调节细胞生长。在正常情况下胞质中存在一定量B - c a t e n i n ，如果B - c a t e n i n 过多，就会出现A P C 、A x i n 、G S K - 3 、B - c a t e n i n 形成的复合物。该复合物有利于G S K - 3 B对B - c a t e n i n 的磷酸化。磷酸化的B - c a t e n i n 将被泛素蛋白水解酶识别，并降解B - c a t e n i n 。在w n t 信号或其他细胞外信号刺激下，w n
16、 t 与细胞表面相应受体卷曲蛋白F r i z z l e d 家族结合，通过D i s h e v e l l e d 蛋白拮抗B 链蛋白降解复合物( A P C A x i n ) 的形成，进而阻断B 链蛋白磷酸化、泛素化【2 6 1 。湖北中医学院2 0 0 6 级针灸骨伤学院在无w n t 时，胞质内高水平的B 链蛋白可以反馈刺激负性调节分子如结肠腺瘤息肉蛋白沁c ) 抑癌基因、糖原合成激酶( G S K - 3 B ) 和A x i n 等的表达，形成多元复合物，促使B 连环蛋白在G S K - 3 B 激酶作用下发生磷酸化，磷酸化的B 连环蛋白结合于B - T R C P 蛋白，再与泛素共价结合，最终被T R C P S L M B 蛋白水解酶降解，使B 链蛋白在胞内的浓度始终维持在较低水平，从而保证细胞行使正常的生理生化功能【2 7 - 3 0 1 。从我们的实验结果可以看出，预
