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1、 分类号： 单位代码：10019 密 级： 学 号：S05040512 硕士学位论文 猪流产嗜性衣原体重组噬菌体omp-1 基因疫 苗免疫应答的研究 Studies on Immune Responses of Recombinant Bacteriophage DNA Vaccine Based on omp-1 gene of Swine Chlamydophila abortus 研究生： 刘伟 指导教师： 何 诚 副教授 申请学位门类级别： 农学硕士 专业名称： 预防兽医学 研究方向： 实验动物学 所在学院： 动物医学院 2008 年 5 月 China Agricultural Un
2、iversity Masters Dessertation Studies on Immune Response of Recombinant Bacteriophage Vaccine Based on omp-1 gene of Swine Chlamydophila abortus Graduate: Wei Liu Supervisor: Cheng He (Asistant Professor) Degree: Master Major: Preventive Veterinary Medicine Specialty: Laboratory Animal Science Colle
3、ge: College of Veterinary Medicine April, 2008 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅
4、，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 目 录 摘 要 . I Abstract . II 缩略词 . III 第一章 引 言 . 1 第一部分 衣原体综述 . 1 1.1 流产嗜性衣原体病原学研究 .1 1.2 猪流产嗜性衣原体的流行 .5 1.3 动物衣原体疫苗的研究进展 .6 第二部分 噬菌体综述 . 8 1.4 噬菌体载体.9 1.5 噬菌体展示技术在疫
5、苗研究方面的应用.12 1.6 佐剂及免疫途径对噬菌体疫苗的影响.13 1.7 本研究的目的及意义 .14 第二章 猪流产嗜性衣原体omp-1基因的克隆 . 15 2.1 试验目的.15 2.2 试验材料.15 2.3 试验方法.16 2.4 结 果.18 2.5 分析与讨论.19 2.6 小 结.20 第三章 猪流产嗜性衣原体omp-1基因噬菌体表达载体的构建. 21 3.1 试验目的.21 3.2 试验材料.21 3.3 试验方法.22 3.4 结 果.28 3.5 分析与讨论.31 3.6 小结.32 第四章 重组噬菌体 omp-1基因疫苗免疫应答评价 . 33 4.1 试验目的.33
6、4.2 试验材料.33 4.3 试验方法.35 4.4 结 果.37 4.5 分析与讨论.39 4.6 小 结.41 第五章 结 论 . 42 参考文献 . 43 致 谢 . 49 个人简介 . 50 I摘 要 摘 要 猪流产嗜性衣原体是比较常见的导致猪流产等多种疾病的病原体。随着我国集约化养殖业的不断发展， 猪流产嗜性衣原体的感染呈现上升的趋势， 并造成重大经济损失。 主要外膜蛋白 （Major Outer Membrane Protein，MOMP）是衣原体膜表面的主要蛋白，具有重要的生物学功能，其保护性抗原的特点使 MOMP 成为衣原体外膜蛋白复合物中的研究热点。为初步探讨猪流产嗜性衣原
7、体噬菌体载体递呈 omp-1 基因疫苗的免疫效果，本研究进行了如下试验： 以本室保存的猪流产嗜性衣原体 CP/12 株重组质粒 pcDNA3.1-omp-1 为研究对象，用 PCR法扩增猪流产嗜性衣原体 omp-1 基因，将 omp-1 基因与噬菌体载体 NM1149 连接后，进行了体外包装。提取纯化该重组噬菌体-MOMP，以 PCR 和酶切鉴定重组噬菌体-MOMP，筛选阳性克隆并测序鉴定。 将阳性克隆转化 C600 表达宿主菌，进行了该重组-MOMP 噬菌体疫苗的大量制备纯化。 将 27 只 Balb/c 小鼠随机分成 3 组， 重组-MOMP 噬菌体疫苗组按 0.25 g/只分别在第 2
8、、16、30 天三次免疫 Balb/c 小鼠；1B 对照组：以 1B 弱毒活疫苗（10 g/只）分别在上述时间进行免疫；噬菌体空载体对照组：以噬菌体质粒按 0.25 g/只三次免疫小鼠。免疫前及每次免疫 14天后采血, 以间接酶联免疫吸附试验（iELISA）检测血清中 IgG 抗体效价；二免、三免结束后，分别分离脾淋巴细胞，以 MTT 法测定 T 淋巴细胞增殖；同时测定血清中的 IFN-和 IL-2 细胞因子。 结果显示： 通过 PCR 法成功的扩增了重组质粒 pcDNA3.1-omp-1 的 omp-1 基因， 与 GenBank中 4 株流产衣原体 omp-1 基因和氨基酸序列的相似性均达
9、 99%； 用重组的 NM1149 表达载体免疫小鼠，观察到重组-MOMP 噬菌体疫苗虽然未能激发高水平的抗体，但能逐渐诱导抗体水平升高，而且显著性诱导 T 淋巴细胞的增殖。相反 1B 组能激发高水平的抗体，但 T 淋巴细胞增殖指数显著性低于噬菌体疫苗。重组-MOMP 噬菌体疫苗能诱导产生 IL-2、IFN-，随着时间延长逐渐增加。1B 组诱导 IFN-升高，IL-2 浓度在三次免疫后逐渐下降，与对照组相比差异不显著。 以上试验表明噬菌体介导的猪流产嗜性衣原体 omp-1 基因疫苗能显著性提高 T 淋巴细胞增殖，诱导产生中等水平的抗体，提高 IL-2、IFN-的分泌，这为开发新型猪流产嗜性衣原体基因疫苗提供一条新的途径。 关键词关键词：NM1149 载体，omp-1，免疫，猪流产嗜性衣原体 IIAbstract Swine Chlamydophila abortus (C.abortus) has been identified as one of the major causes leading to abortion as well as many ot
