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1、Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, March 2011, Vol. 25, No.3354局部联合应用 NGF 及胰岛素对糖尿病大鼠烫伤创面血管形成及 Bcl-2、 Bax 表达的影响张冀北 薛晓东 谢沛霖 常飞【摘 要】 目的 探讨局部应用 NGF 联合胰岛素对糖尿病大鼠烫伤创面血管中凋亡相关因子 Bcl-2、 Bax 表达的影响及创面愈合的机制。 方法 取 75 只清洁级雄性 Wistar 大鼠， 体重 200 220 g， 随机分为正常对照组 （A 组） 、 糖尿病对照组 （B 组） 、 胰岛素治疗组 （C
2、 组） 、 NGF 治疗组 （D 组） 、 NGF 联合胰岛素治疗组 （E 组） ， 每组 15 只。B、 C、 D、 E 组大鼠采用两步给药法腹腔注射链脲佐菌素 （streptozotocin， STZ） 建立糖尿病模型， STZ 剂量分别为第 1 天 10 mg/kg， 第3 天 50 mg/kg ； A 组给予相同剂量柠檬酸缓冲液。模型制备后 1 个月， 采用水蒸气烫伤法于各组大鼠背部制备 2 个深度烫伤创面。烫伤模型制备后， A、 B 组创面外敷 3 层生理盐水纱布 ； C 组创面外敷 3 层浸润 5 U 胰岛素诺和灵 30R 的纱布，并每日腹部皮下注射诺和灵 30R 4 6 U/kg
3、 ； D 组创面外敷 3 层浸润 5 mL NGF 溶液 （25 U/mL） 的纱布 ； E 组联合 C、 D组方法处理。观察大鼠一般情况， 伤后 7、 11、 15、 21 d 大体观察各组创面愈合情况并计算创面愈合率， 伤后 3、 7、 11、 15、21 d 取创面组织行组织学及免疫组织化学染色观察， 检测创面 Bcl-2、 Bax、 CD34 的表达并计算微血管密度。 结果 各组大鼠均存活至实验完成。随时间延长， 各组创面逐渐缩小， 其中 E 组创面愈合速度、 皮肤角化、 毛发生长及肉芽组织和胶原纤维生长均优于其余各组。伤后各时间点 E 组创面愈合率均高于其余各组， 差异有统计学意义
4、（P 0.05） 。C、 D 组伤后 11 d 开始创面愈合率显著高于 B 组， 差异有统计学意义 （P 0.05） ， 伤后 21 d 表达较 A 组明显降低， 差异有统图 1 各组伤后 15 d 创面大体观察 a A 组 b B 组 c C 组 1 d D 组 e E 组 图 2 各组伤后 15 d 创面组织学观察 （HE 400） 箭头示新生胶原纤维 a A 组 b B 组 c C 组 1 d D 组 e E 组 图 3 各组伤后 15 d 创面 CD34 表达观察 （SP 400） 箭头示阳性内皮细胞 a A 组 b B 组 c C 组 1 d D 组 e E 组Fig.1 Gross
5、 observation of wounds at 15 days after injury in different groups a Group A b Group B c Group C 1 d Group D eGroup E Fig. 2 Histological observation of wounds at 15 days after injury in different groups (HE 400) Arrow showed new collagen fiber a Group A b Group B c Group C 1 d Group D e Group E Fig
6、.3 CD34 expression of wounds at 15 days after injury in different groups (SP 400) Arrow showed positive endothelial cell a Group A b Group B c Group C 1 d Group D e Group EChinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, March 2011, Vol. 25, No.3358计学意义 （P 0.05） ； A 组各时间点表达均低于 B 组，差异均有统计学意义
7、 （P 0.05） 。见表 4。3 讨论 糖尿病创面修复是一个复杂的生物学过程， 涉及创面炎性反应、 新生血管再生、 肉芽组织增生以及再上皮化等过程， 有许多细胞因子参与及调控10。创面愈合过程中， 各阶段均有细胞凋亡发生， 糖尿病创面难愈提示存在异常的细胞凋亡过程11。Bcl-2 与 Bax 是影响细胞凋亡的重要调控基因。Bcl-2 通过抑制细胞色素的释放， 增强内皮细胞的抗氧化作用， 保护内皮细胞的结构和功能 ； Bcl-2 的过表达能保护内皮细胞因化学因子、 炎性介质等所致的细胞凋亡12。而 Bax 作用与Bcl-2 相反， 它是通过对抗 Bcl-2 发挥其在细胞凋亡中的诱导作用。Bax
8、 不仅本身能诱导细胞凋亡， 而且可以与前者一起调控细胞凋亡13。 表 2 各组各时间点大鼠创面微血管密度测定 （n=6， 条 / mm2， x s）Tab.2 Comparison of microvessel density among 5 groups at different time points（n=6， vessel/mm2， x s）组别 Group3 d7 d11 d15 d21 dA32.14 2.21#41.19 2.40#46.39 3.08# 54.86 3.98# 39.44 2.62# B27.82 2.86* 31.67 1.93* 34.19 2.22* 39.
9、61 4.01* 29.85 2.89* C30.15 1.46*#37.25 3.09*# 42.76 3.83*# 48.64 4.23*# 41.34 4.08# D35.87 4.88#43.74 3.31#58.25 3.56*#68.33 4.42*#47.72 2.92*#E43.04 2.03*# 55.12 4.12*# 63.82 3.65*# 78.81 5.04*# 62.20 3.03*# 统计值 StatisticF=74.42 P= 0.00F=82.37 P= 0.00F=118.22 P= 0.00F=114.51 P= 0.00F=169.01 P= 0.0
10、0*与 A 组比较 P 0.05，#与 B 组比较 P 0.05，与 C 组比较 P 0.05，与 D 组比较 P 0.05 * Compared with group A, P 0.05; #compared with group B, P 0.05; compared with group C, P 0.05; compared with group D, P 0.05表 3 各组各时间点大鼠创面血管内皮细胞 Bcl-2 表达 （n=6， %， x s）Tab.3 Comparison of Bcl-2 expression among 5 groups at different time
11、 points（n=6， %， x s）组别 Group3 d7 d11 d15 d21 dA 20.71 1.86#28.29 2.58#36.67 2.17# 50.92 1.52# 43.67 1.62# B 15.34 1.33*24.44 2.07*30.22 2.74* 35.88 2.31* 31.76 1.89* C 17.17 1.28*25.80 3.31*34.30 2.63*# 49.15 2.10*# 41.81 1.47*# D 16.61 1.7730.57 2.5141.34 2.21*#56.84 1.62*#48.20 0.93*#E 21.63 2.184
12、1.32 1.95*# 53.38 1.71*# 69.02 1.15*# 55.88 0.79*# 统计值 StatisticF=24.96 P= 0.00F=15.40 P= 0.00F=147.69 P= 0.00F=179.92 P= 0.00F=194.83 P= 0.00*与 A 组比较 P 0.05，#与 B 组比较 P 0.05，与 C 组比较 P 0.05，与 D 组比较 P 0.05 * Compared with group A, P 0.05; #compared with group B, P 0.05; compared with group C, P 0.05;
13、compared with group D, P 0.05表 4 各组伤后 7、 11、 15、 21 d 大鼠创面血管内皮细胞 Bax 表达 （n=6， %， x s）Tab.4 Comparison of Bax expression among 5 groups at 7, 11, 15, and 21 days（n=6， %， x s）组别 Group7 d11 d15 d21 dA 17.33 2.79#26.17 2.79# 34.43 1.84# 46.88 0.92# B 22.43 2.39* 33.77 1.96* 45.36 0.79* 53.33 0.81* C 19.
14、91 1.93# 24.39 2.46# 35.58 1.51# 45.71 1.42*# D 16.02 1.51#21.61 0.18*#31.32 2.00*#42.28 1.17*#E 12.61 2.22*# 18.44 0.88*# 24.57 1.43*# 32.61 1.78*# 统计值 StatisticF=19.46 P= 0.00F=75.25 P= 0.00F=103.95 P= 0.00F=124.96 P= 0.00*与 A 组比较 P 0.05，#与 B 组比较 P 0.05，与 C 组比较 P 0.05，与 D 组比较 P 0.05 * Compared wit
15、h group A, P 0.05; #compared with group B, P 0.05; compared with group C, P 0.05; compared with group D, P 0.05中国修复重建外科杂志2011年3月第25卷第3期359创面愈合过程中必须有丰富的新生血管供给修复组织充足的血液和养分。由于大多数 CD34 细胞是毛细血管内皮细胞的祖细胞14， 且组织中毛细血管内皮细胞 CD34 表达多呈阳性， 故抗 CD34 抗体主要用来标记毛细血管内皮细胞15， 因此， 根据 CD34 表达计算出的微血管密度是新生血管形成的量化指标。本研究结果显示， E 组创面新生血管内皮细胞Bcl-2 表达于伤后 7 d 即开始增加， 至 15 d 达高峰， 与其余各组比较差异均有统计学意义 ； 伤后 3 d 各组均未见 Bax 表达， 7 d 后开始见各组新生血管内皮细胞Bax 表达， 并随时间延长
