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1、 1 现代生命科学研究技术实验指导 EMSA 验证蛋白与 DNA 的结合利用凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白与 DNA 的结合利用凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白与 DNA 的结合 一、实验原理及应用 一、实验原理及应用 凝胶阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA） ，是一种研究蛋白和核酸相互作用的技术。蛋白质与放射性标记或生物素标记的探针结合后，形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率比自由探针的迁移率大大降低，表现为条带滞后。 凝胶阻滞实验具有简单、快捷、灵敏等优点，可用于检测 DNA 结合蛋白、RNA 结合蛋白，并可通过加入特
2、异性的抗体来进一步确定阻滞条带所结合的蛋白质。结合定点突变技术，还可以用来研究蛋白结合核酸的关键位点。 许多生物学过程，如染色体的包装、维持及控制，都与蛋白质-DNA 间的非特异性相互作用有关。 在古菌中发现的某些小分子量 DNA 结合蛋白具有与组蛋白类似的功能，按分子量不同分为 7kDa、8kDa 和 10kDa 三类。本实验中所用的蛋白质 Sul7d 是来源于嗜酸热硫化叶菌 （Sulfolobus acidocaldarius） 中的 7kDa蛋白，能够和 DNA 非特异性结合。本实验中利用 EMSA 实验验证体外表达的Sul7d 蛋白和 DNA 的相互作用。60 bp 的 DNA 片段由
3、公司合成。部分 DNA 片段由生物素标记。将纯化好的 Sul7d 蛋白与 DNA 底物共孵育，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；将凝胶上的样品转移到 NC 膜，利用显色剂显影后即观察到目标蛋白与不同结构底物的结合情况。 生物素标记法采用随机引物标记法，利用 DNA 聚合酶，以目标 DNA 为模板， 以随机引物为起始引物， 将生物素标记的dUTP引入到合成的DNA探针中，产生高活性生物素标记的 DNA 片段。 生物素标记相对于同位素标记， 操作方便、安全。 为了获得准确的实验结果，还应该在蛋白质-核酸混合液中分别加入不同浓度的“竞争剂” （competitor） 。竞争剂与探针序列相同，但没有被
4、标记。如果被检测的滞后条带随“竞争剂”浓度增加而逐渐减弱，说明蛋白质和探针之间的结合是特异的。 2 现代生命科学研究技术实验指导 EMSA 验证蛋白与 DNA 的结合二、实验材料、试剂、仪器 二、实验材料、试剂、仪器 1.实验材料： 1.实验材料： （1）纯化好的目标蛋白 Sul7d(4mg/ml) （2）具有特定序列的寡核苷酸双链（由公司合成） ，60 bp 左右 2.试剂： 2.试剂： （1）非变性聚丙烯酰胺凝胶试剂，胶浓度为 5%，现用现配。 （2）DNA 片段标记试剂盒（如生物素化标记） （3）寡核苷酸纯化试剂盒 （4）5蛋白-DNA 结合缓冲液： 100%甘油 500 l 1 mol
5、/L Tris(pH8.0) 250 l BSA(10 mg/ml) 125 l 5 mol/L NaCl 30 l 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 10 l 1 mol/L 二硫苏糖醇（DTT） 10 l H2O 75 l 总体积： 1000 l （5）非特异竞争物：10 mg/ml，用灭菌 ddH2O 配制。 （6）电泳缓冲液 0.5TBS（由 10储液配制） （7） 蛋白质样品缓冲液 （非变性,5） ： 30%甘油， 0.25% 溴酚蓝， 0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8 3仪器及用品仪器及用品 电泳仪、镊子、剪刀、尼龙膜、蛋白湿转仪、摇床、紫外交联仪、水浴锅
6、、X- 光片、暗室、洗片设备等。 三、实验步骤 三、实验步骤 1丙烯酰胺凝胶的配制 1丙烯酰胺凝胶的配制 配制5%非变性聚丙烯酰胺凝胶，使用常规的制备蛋白电泳胶的模具，注意不能有SDS残留。待胶完全凝后，小心将梳子拔掉，电泳槽加入预冷的0.5TBE 缓冲液至加样孔底部，100V电压预电泳1小时。 2DNA片段的标记 2DNA片段的标记 按照试剂盒具体说明严格操作。 3 现代生命科学研究技术实验指导 EMSA 验证蛋白与 DNA 的结合3. EMSA结合反应 3. EMSA结合反应 按照下述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的DNA片段前先混匀，室温(2025)放置10min，从而消除可能发生的
7、DNA和蛋白的非特异性结合。然后加入标记好的DNA，混匀，室温(2025)放置20min。 表1. 蛋白质与探针的结合反应 试剂 阴性对 照 样品反 应 竞争反应1竞争反应2 表1. 蛋白质与探针的结合反应 试剂 阴性对 照 样品反 应 竞争反应1竞争反应2 ddH2O 14l9 l8 l 7 l 5结合缓冲液 4 l4 l4 l 4 l Poly (dIdC) 1l 1l1l 1l Sul7d蛋白质样品 5l5l 5l 未标记探针（特异竞争 剂） 1 l 2 l 标记探针 1l 1l1l 1l 4. 电泳 4. 电泳 将上述样品分别加入5l上样缓冲液（5），混匀后立即上样，100 V 电压，
8、冰浴中电泳约1 hr。胶的温度不能超过30，如果温度升高，可适当降低电压。待上样缓冲液中的前沿指示剂溴酚蓝移至胶的下缘1/4处时停止电泳。 5. 转膜 5. 转膜 （1） 取一张和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜， 剪角做好标记， 用0.5TBE浸泡至少10min。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。 （2） 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5TBE浸湿。 （3） 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，尼龙膜和滤纸间不能有气泡。小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，确保胶和膜之间没有气泡。另取一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，确保滤纸和胶之间没有气泡。
9、 （4） 利用湿法电转膜方法， 以0.5TBE为转膜液， 在冰水浴中进行转膜， 100V电压下约3060min。 （5） 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，小心吸掉表面明显的液体。 立即进入下一步的交联步骤， 不可使膜变干。 4 现代生命科学研究技术实验指导 EMSA 验证蛋白与 DNA 的结合6. 交联 6. 交联 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45 sec。 7. 化学发光法检测生物素标记的探针 7. 化学发光法检测生物素标记的探针 （1） 37水浴溶解封闭液和洗涤液。取一套干净方形培养
10、皿，加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜，在摇床缓慢摇动15min。 （2） 同时，取5l辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（Streptavidin-HRP）结合液加入到15ml封闭液中(1:3000稀释)，混匀备用。 （3） 去掉（1）中培养皿中的封闭液，加入（2）中配制的15ml含有Streptavidin-HRP结合液的封闭液，继续在摇床上缓慢摇动15min。 （4） 将尼龙膜转移至另一装有15ml洗涤液的干净方培养皿，漂洗5min，然后将洗涤液倒掉，重新加入15 mL 洗涤液继续在摇床上缓慢摇动5 min，共洗涤四次。 （5） 将尼龙膜转移至另一装有20ml平衡液的干净方培养
11、皿，在摇床上缓慢摇动5min。同时，取荧光检测试剂（ECL）的工作液A和工作液B各5ml，混匀，配制成显色工作液。 （6） 取出尼龙膜，用吸水纸吸去多余液体后，将膜的样品面向上，在尼龙膜的表面小心加上配制好的共10ml显色工作液， 使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置5min。 （7） 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜中，固定于压片暗盒内。用X光片压片15min。可以先压片1min，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间。 四、数据与结果分析 四、数据与结果分析 根据显色结果，验证目标蛋白与 DNA 底物的结合现象。蛋白质与 DNA 结合后形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝
12、胶中比游离的 DNA 迁移慢， 可以根据迁移率的变化来判断。 5 现代生命科学研究技术实验指导 EMSA 验证蛋白与 DNA 的结合五、参考文献 五、参考文献 1 DR.马歇克 JT.门永等蛋白质纯化与鉴定实验指南朱厚础译，北京：科学出 版社，2002，126 2 Taylor JD, Ackroyd AJ, Halford SE. 1994: The gel shift assay for the analysis of DNA-proten interactions. Methods Mol Biol 30:263-279 3 3. Chen X, Guo R, Huang L. 2002. Evolutionary conservation and DNA binding properties of the Ssh7 proteins from Sulfolobus shibatae. Sci China Ser C. 45:583-592
