生物技术用于黄瓜遗传育种

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1、生物技术用于黄瓜遗传育种张圣平1 顾兴芳1 许文连2 王烨1(1中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081 ;2山东省成武县蔬菜局,成武 274200)摘 要: “十五” 期间,生物技术在黄瓜遗传育种上的应用更加广泛,分子标记辅助育种、 单倍体育种以及黄瓜基因工程改良取得了重要进展。本文综述了黄瓜基因分子标记、 遗传图谱构建、 基因定位、 基因克隆与表达、 品种DNA指纹图谱分析、 分子技术鉴定病害、 单倍体和三倍体培养、 遗传转化体系建立及基因工程改良方面的最新进展,并讨论了存在的问题和前景。关键词: 生物技术 黄瓜 遗传育种Application of Biotechnology o

2、n Genetics and Breeding of CucumberZhang Shengping Gu Xingfang Xu Wenlian Wang Ye(1Institute of Vegetables and Flowers , Chinese Academy of A gricultural Sciences Beijing 100081;2Vegetable Bureau of Chengwu County in Shandong Province , Chengwu 274200)Abstract : The application of biotechnology on g

3、enetics and breeding research of Cucumber during “ The TenthFive2years Plan“ went deeper into. Molecular marker2assisted breeding , haploid breeding and genetic engineeringimprovement in cucumber were gained significant development. The recent progress of gene molecular markers , mo2lecular genetic

4、map construction , gene locating , gene clone and expression , DNA fingerprinting analysis , identifyingdiseases using molecular technology , haploid and triploid culture , genetic transformation system and genetic engi2neering improvement in cucumber were summed up. And the problems to be solved an

5、d prospects of were discussed.Key words: Biotechnology Cucumber Genetics and breedieg“十五” 期间,黄瓜育种研究首次被列入国家“863” 项目,育种方法和技术得到了快速发展。广大 科研工作者利用生物技术结合常规育种方法,创新 了一大批含有优异基因的育种材料,培育出多个丰 产、 优质、 多抗品种。生物技术在黄瓜遗传育种上的 应用更加广泛,分子标记辅助育种、 单倍体育种以及黄瓜基因工程改良取得了重要进展。1 分子标记技术在黄瓜遗传育种中的应用1. 1 黄瓜基因的分子标记开展基因分子标记研究是进行分子标记辅助选 择

6、育种、 分离和克隆基因的基础。 “十五” 期间,我国 科研工作者建立了适合黄瓜的RAPD、AFLP和SSR标记的优化反应体系,并对黄瓜的多个基因进行了分子标记。钱忠英等1优化的黄瓜RAPD反应体系为:PCR程序94 预变性3min ,94 变性30s ,37复 性30s ,72 延伸2min ,循环40周,最后72 延伸7min为佳;模板DNA的适宜浓度为2. 55 ng/ l ,引物浓度为0. 6mol /l , dNTPs浓度为0.25mmol/ L ,Mg2 +浓度为1. 875mmol/ L。张桂华 等2建立了适合黄瓜的AFLP反应体系:在50L 酶切连接体系中,取300ng基因组DN

7、A进行双酶 切和接头连接,然后取4l酶切连接产物进行预扩 增(预扩增体系为20l) ,预扩增产物稀释30倍后,采用 “2 + 3” 选择性扩增引物组合用于选择性扩增可 以得到很好的扩增效果。葛风伟3等摸索了适宜黄收稿日期:2005212221作者简介:张圣平(19752) ,男,中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜遗传育种课题组,电话:010268918755 ,E2mail :zhangshp caas. 生物技术通报 技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULL ETIN 2006年第2期瓜的SSR反应体系,认为在25l PCR反应体系中,Mg2 +的最适浓度为0. 2mmol/ L ;d

8、NTP最适浓度 为0. 2mmol/ L ;反应体系中Taq聚合酶宜加入1U , 引物应加入30ng ;DNA最适浓度为5ng/l。另外,刘殿林4、 张正奇5、 孙敏6等也对黄瓜基因组DNA提取方法和RAPD反应体系进行了探索。 基因分子标记方面,陈劲枫等7利用RAPD技 术获得黄瓜全雌性特异的片段B111000。娄群峰等8筛选得到了与黄瓜全雌性F基因连锁距离为6. 7cM的AFLP标记TG/ CAC234,并将该标记转化为SCAR标记SA166。张桂华等9找到两个与白粉 病抗病相关基因连锁距离为5. 56 cM的AFLP标 记,目标片段的大小分别为238 bp和236bp。张素 勤10研究并

9、获得了与控制黄瓜霜霉病和白粉病的 感病QTLs均 紧 密 连 锁 的 显 性AFLP标 记:E25M632103 ,与黄瓜霜霉病、 白粉病某个数量感病 基因共分离,而抗病亲本及抗病单株没有带。E25M632103标记从分子水平说明黄瓜霜霉病和白 粉病的某个感病QTLs是连锁的。丁国华11筛选 得到与抗霜霉病基因dm连锁不十分密切的CsR2GA3标记。在dm和CsRGA3之间还检测到黄瓜 白粉病抗病基因pm的存在,显示了dm和pm存在 连锁关系。这与张素勤等的结论一致。国艳梅12 筛选到的AFLP标记E4M6和E5M5 ,分别与黄瓜营养部分苦味基因Bi和与的连锁距离15. 0cM和 不苦基因bi

10、连锁距离18. 8cM。顾兴芳13等找到 了与黄瓜果实苦味基因Bt紧密连锁的两个显性AFLP标记E23M662101和E25M652213 ,与Bt的 遗传距离分别为5 cM和4 cM ,且位于Bt两侧,可 用于无苦味黄瓜的分子标记辅助育种。1. 2 黄瓜遗传图谱的构建与基因定位 “十五” 期间,我国科研工作者构建了2张黄瓜 遗传图谱,其一是张海英等14利用黄瓜重组自交系 为作图群体,构建的包含9个连锁组群,共有234个 分子标记的连锁图谱,其中包括141个AFLP标记、4个SSR标记和89个RAPD标记,覆盖基因组 长度727. 5 cM ,平均图距3. 1 cM。应用该图谱对 控制黄瓜耐弱

11、光的数量性状基因(Q TL)进行了研 究,将影响叶面积增长量的5个QTL分别定位在L G1、L G7和L G9连锁群15。其二为李效尊等16利用F2代群体,构建的包含77个SRAP标记和79 个RAPD标记的遗传图谱,分属4个大的连锁群和5个小的连锁群,总长度1110. 0cM ,平均间距为13. 7cM.。并将侧枝基因(lb)定位在一个大的连锁群上,其两侧标记是OP2Q521和OP2M2222 ,与lb的 间距分别是9. 3cM和15. 9cM ;将全雌性基因(f)定 位在一个小的连锁群上,其两侧标记是OP2Q522和BC151 ,与f的间距分别是13. 8cM和13. 6cM。1. 3 分

12、子标记在黄瓜亲缘关系和遗传多样性上的研究 分子标记技术以其准确性高、 速度快、 周期短而 较多地应用于黄瓜种质亲缘关系分析和种质资源多 样性检测方面。利用RAPD标记进行研究的报道 有:张海英等17利用RAPD技术分析了华北型与欧洲温室型品种的杂交后代的遗传漂移情况,根据供 试亲本材料差异位点谱带在F2的分离情况,进行 了初步的遗传分析以及F2个体的基因型分析。刘 殿林等18分析了39份黄瓜材料的遗传差异,不同 材料间的遗传距离(D)在0. 06420. 592之间,并根据遗传距离,按UWPGA法进行了聚类分析。夏立新 等19通过RAPD分析计算出黄瓜亲本间分子遗传 距离,研究了田间园艺性状与

13、分子遗传距离间各种 相关曲线的相关系数,发现两者间以抛物线的相关 系数最优,其中座瓜率、 收获始期与分子遗传距离的抛物线相关系数存在着显著相关性。陈劲枫等20 对黄瓜属的22份材料的亲缘关系进行了研究,聚类 分析为2群:CS群(黄瓜、 西南野黄瓜及野黄瓜)和CM群(甜瓜、 菜瓜、 野生小黄瓜及非洲角黄瓜)。庄 飞云等21也利用RAPD技术,将23份材料按亲缘关系聚类为黄瓜、 近缘野生种、 种间杂交种和甜瓜亚 属种4类。李锡香等22利用29个RAPD引物分析 了66份黄瓜种质基因组DNA ,将供试种质分为8 个组群。另外,利用RAPD标记可以从分子水平上 探测黄瓜亲本自交系与其杂种F1代的遗传差

14、异23。AFLP技术也经常用在亲缘关系和遗传多样性 研究上面。王志峰等24利用AFLP技术对包括80 份山东黄瓜地方品种和24份其它地区品种的遗传 亲缘关系进行了研究,聚类分析结果显示:山东黄瓜地方品种与日本品种和欧美品种分属不同类群或亚83 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2006年第2期类群,山东地方品种分为8组,各组内生态类型基本 一致。AFLP分析计算出15份密刺类黄瓜品种的 遗传距离在0. 0330. 686之间,聚类分析分为8 类,新泰密刺和山东密刺遗传差异较小,与长春密刺遗传差异较大25。李锡香等26以8对引物对70份 不同来源的野生和栽培黄瓜种质基因组

15、DNA进行AFLP分析,将供试种质聚类为三大种群,西双版纳 黄瓜组群、 印度野生黄瓜组群和栽培黄瓜组群。 另外,李俊英等27发现在不同黄瓜品种的线粒体中存在类质粒分布的差异,其存在有一定随机性, 不同品种中的同一种类质粒间具有同源性。1. 4 黄瓜基因的克隆与表达 黄瓜基因克隆在 “十五” 期间进展较快,有多篇 报道。康国斌等28克隆得到了在黄瓜冷敏型品种低温锻炼中特异表达基因的cDNA片段(ccr18) ,大 小为639 bp。在基因组中以单拷贝或低拷贝形式 存在。ccr18基因与黄瓜低温锻炼相关,与拟南芥染 色体III BAC库中的F14P3基因组序列具有88 % 的同源性。李俊英等29测

16、定了黄瓜线粒体类质粒pC4的基因序列,全长370 bp ,是已知的植物线粒体 类质粒中最短的。pC4富含AT ,有多个正向和反 向重复序列,其两端为35 bp的正向重复序列。白 吉刚30等扩增出黄瓜生长素结合蛋白基因(ABPl)cDNA片段,大小约为800bp ,该基因在开花前1d的子房中表达信号较弱,在授粉后2、4和6d的幼果 中表达增强 。Southern杂交结果表明,黄瓜生长素 结合蛋白为小基因家族编码。丁国华等31利用简 并引物从黄瓜基因组DNA中分离得到15条同时 具有特征保守域结构的NBS类型抗病基因同源序列(RGA) ,翻译产物与许多抗病蛋白有较高的同 源性。 牛林海32克隆了黄瓜HMG (high mobilitygroup proteins)基因,并认为该基因是单拷贝,具有 组织特异性表达,根中表达