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1、钙离子对热带假丝酵母细胞生长的影响华玉涛焦鹏誊竹安( 清华大学化工系生物化工研究所，北京，1 0 0 0 8 4 )摘要：在鼻糖细胞中，酣+ 对调控细胞劝匏起着重要作用，特别是它是细胞用期中的一种生长调控物质对于调控细胞在G l 期内的行为，咀及G 2 M 期的过泣是至关重要的袁们研究了C 矿对热带饭韭酵母增殖的影响，发现钙离子的加八时细胞增殖是有促进作用的可以加快细胞周期，促进作用的强弱依c 一+ 1 津度不同而异最适浓度在I O 。l 酽m o l L 之间津度过高( 高于1 0 。I m o l L ) 畚对生长起抑制作用最佳钙离子浓度下同期茸浓比空白样高出3 4 关奠词热带饭韭酵母钙离
2、干细胞周期长链= 元酸与原核生物中染色体的复制期和分离期的重叠不同真核生物的细胞周期是由一连串分立的事件组成的循环。这个循环由细胞周期调控的机制启动，这个机制同时还控制着中心体的复制和细胞分裂i 并把这些不连续的事件与细胞生长结台起来【”在一些真核生物中，细胞周期调控的激酶需要钙和钙调素( C a l m o d u l i n 简称C a M ) 激活，而钙和钙调索在许多生物细胞中以是主要的胞内信使参与基因活化和细胞生长发育的调节。大量研究表明钙有许多生物学功能，大致可以归纳为以下四个方面：A 结构作用。钙是细胞内含量最多的无机元素之一。B 电导作用。C 与许多酶和蛋白协同作用。有些细胞外降
3、解酶需要C a 2 + 来保持它的稳定性和达到最大活性。D 细胞内的调节作用钙的第二信使作用主要表现在这一点上。一些过程如有丝分裂中一些蛋白的合成和分解，启动子的激活与纺锤体相关的膜传递，染色体的浓缩和成熟，都是由受胞内自由钙离子浓度变化刺激的分子过程调节的f 2 】。在哺乳动物细胞的细胞周期中，C a 2 + 是G l 期的调控物质。在有足够的血清但C a 2 + 不足的情 况下，鼠3 T 3 细胞及心室细胞都被抑制在G 1 期。另外，血清缺陷型人纤维原细胞W I 3 8 在缺乏C a 2 + 的介质中不能进入s 期。一些生长因子如源自血小板的生长因子，会促使C a ”从内部储备释放而引起胞
4、液中自由钙离子浓度的短暂上升，但这种作用同时还依赖于细胞外的钙离子，而外皮生长因子引起的【c 一+ 】上升则完全依赖于外部的钙离子。这些发现表明细胞外的钙离子对G 1期的调节起着决定性作用【”。关于钙离子和钙调紊对酵母细胞增殖的调控也有许多报道。胞内自由钙离子浓度的增加刺激细胞壁组分的合成，并可调控肌动蛋白的分布，提高细胞质膜的稳定性，从而影响到酵母增殖的过程。在酿酒酵母( S a c c h a r o m y c e sc e r e W s i a e ) 中，用多克隆抗体间接免疫定位的方法，发现钙调素分布随细胞周期的变化而变化。与肌动蛋白相似，钙调素分布在生长活跃的部位，参与酵母细胞的
5、极性生长过程。在未出芽的细胞中，钙调素分布在要出芽的部位在生出小芽的细胞中钙调素均匀分布在整个小芽中，随小芽的生长，钙调素先集中在芽顶端，然后向下扩散，在胞质分裂前，钙调素集中在芽颈区横隔壁形成的部位。而且在细胞周期中钙调素和肌动蛋白的分布是相互依赖的推测钙调素可能与肌动蛋白协同作用刺激酵母细胞的出芽过程1 4 J 。有研究表明外加不同浓度的钙调素对酵母细胞的增殖也有明显的影响I S 。遗传学的研究也表明C a 2 + 与酵母细胞的有丝分裂有关。一支不能合成钙调素的缺陷型菌株不能进行细胞核的分裂另外两种失去编码C a 2 十结合蛋白基因C D C 3 1 和C D C 2 4 的菌株，不能进行
6、纺锤体的复制，而这是一般细胞周期中进入s 期及出芽的先决条件f 】。2 3 0在对酿酒酵母的研究中发现，加入C a 2 + 离子载体A 2 3 1 8 7 或螯台剂E G T A 降低培养基中C a r ,浓度后导致短暂的G l 期的停滞，随后大部分细胞的分裂被阻滞在G 2 M 期同时研究还表明除了D N A 合成的启动C a 2 + 在细胞周期的所有阶段中都是必需的。c A I v I P 是酿酒酵母细胞周期中G l 期的正向影响因子，【c a l 下降同时还导致c A M P 水平的下降科。赵宝华等人的研究工作 发现外加不同浓度的钙离子对酵母细胞的增殖有明显的影响阐对于利用热带假丝酵母转化
7、烷烃生产长链二元酸的发酵，通过考察培养基中钙离子浓度对细胞的生长的影响缩短细胞周期，加快细胞的生长速度则可以缩短发酵周期并为提高产酸打下基础。1 试验材料与方法菌株；清华大学化工系生物化工研究所保存的热带假丝酵母( C a n d i d at r o p i c a l i s ) C T1 - 1 2 。培养基：S E L 培养基( ) ：N a , z l - I P O ( 。O 0 2 ；K 2 H P 0 bO 0 4 ；N a C l ，0 1 ；N H 4 C l ，O 4 1 ；葡萄糖，2 。种子培养基( ) ：蔗糖3 ；( N 吼) 2 S 0 0 0 5 ；玉米浆，O 1
8、 ；酵母膏，0 1 ；V mO 0 1 ；N a C l ，0 1 ；K H 2 1 0 4 0 2 ；N a 2 心0 4 ，0 1 ；尿素，0 1 5 ；p H5 0 。 C a 2 + 由C a C I ，提供。培养基的配制选用重蒸水以尽可能消除水中所带C 矿产生的影响。其它试剂均为分析纯。菌体生长情况的测定：用溶媒和水按2 ：1 的比值稀释菌液r l 倍在6 2 0 r i m 下测O D 值。生长初期，每6 8 小时取样测定一次菌浓，进入指数生长期后，每3 4 小时取样一次。 2 试验结果2 1S E L 培养基中不同浓度钙离子对细胞生长的影响我们首先选用了的S E L 基本培养基，
9、以消除未知的干扰因素的影响，并将培养基中加 的钙离子浓度定为l O 、1 0 。、1 旷和1 0 “ 6 m o l L ，另加一空白对照。测定结果如图1 所示。由图可以看出，生长初期( 1 0 小时左右) 各组之间的差异是很小的随着生长的进行各组逐渐显现出菌浓的不同。因为培养条件除钙离子浓度外，其他都是相同的，所以可以说明外加钙离子对细胞生长是有影响的。进一步我们可以看到1 0 、1 0 - 2 、1 0 4 和1 0 m o l L 四个钙离子浓度下的生长情况均比对照组要好，说明钙离子的加入对细胞的增殖确有促进作用的。由图还可以看出，对细胞增殖的促进程度是与钙离子浓度相关的，在1 0 “
10、6 - 1 0 m o l L 范围内时弼I h )图1S E L 培养基中不同时间不同钙离子浓度对细胞生长的影响2 3 I时问( h )图2 种子培养基中不同时间不同钙离子浓度对细胞生长的影响随钙离子浓度的增加，对细胞增殖的促进作用也增强考虑到重蒸水中依然含有一定的钙离子( 在重蒸水中的钙离子浓度与1 0 “ S m o l L 的样品约在一个数量级这也是空白样品中细胞能够生长的 一个原因) 所以对于低钙离子浓度的样品( 如1 0 “ 6 m o l ，L ) 实验存在一定的误差，但重蒸水中所含钙离子对于高浓度钙离子样品而言可以忽略，其实验结果可信。在1 0 。m o F L 钙离子浓度下促
11、 进作用最强，最高比同期空白样品的苗浓高8 0 。钙离子浓度继续增加，达到1 0 “ 1 m o F L 时对增殖的促进作用有所减弱估计可能是如此高的离子强度下过高的渗透压对细胞生长产生了一定的抑制作用，并部分抵消了钙离子对细胞的促进作用。由于钙的溶解度限制，无法进行更高浓度的实验。但是就此已经可以判定。在S E L 培养基中钙离子的最佳浓度为1 0 。m o F L 。2 2 种子培养基中不同浓度钙离子对细胞生长的影响由上步实验结果，在S E L 培养基中加入钙离子对细胞增殖的确有促进作用最佳浓度为1 0 4m o F L 。由于我们在实际的培养和发酵中使用的是种子培养基，所以我们进一步考察
12、了种子培养基中引入钙离子的影响C a C l 2 的在培养基中加入的浓度与用S E L 培养基实验时的相同，分别为 1 0 、i 0 4 、1 0 4 、1 0 4 和0 m o F L 由图2 可见，与S E L 培养基中的情形相似在种子培养基中加入钙离子同样对生长是有促进作用的，促进作用的强弱与钙离子的浓度有关。不同的是种子培养基中的最佳浓度为1 0 。m o l 儿( 在此浓度下同期菌浓比空白样高3 4 ) ，而S E L 培养基中的最佳浓度是1 0 “ h n o l L 估计这是由于种子培养基中含有玉米浆、酵母膏等成分中所含有钙元素，其实际浓度高于加入的钙离子浓度。实际的钙离子浓度可
13、以通过进一步的试验进行测定，但有一点是可以肯定的，即种子培养基中引入钙离子同样会对生长有促进作用引入钙离子的最佳浓度为1 0 “ 4 m o F L 。由于同样的原因，在1 0 “m o l L 的溶液中，实际钙离子浓度高于1 0 q m o F L ，萄体浓度比空白样要低，说明这个浓度已经对生长产生了抑制。而在S E L 培养基中此浓度对生长仍有促进作用这验证了前面的分析，即过高的钙离子浓度对酵母的生长会起抑制作用。 3 结论以上试验表明，在适当的浓度下，钙离子的加入对细胞增殖是有促进作用的，且促进作用随钙离子浓度的增加而增强；但钙离子浓度过高( 高于1 0 一m o l L ) ，对细胞增
14、殖的促进作用有所减弱，并会对生长会起抑制作用。 S E L 培养基中的最佳钙离子浓度为i 口o l L 由于在基本培养基中所加入的钙离子基本代表发酵体系中钙离子的实际浓度所以对热带假丝酵母细胞生长有最佳促进作用的钙离子浓度可能就是1 0 m o l L 种子培养基中外加的最佳钙离子浓度为1 0 “ m o l L ，此浓度下同期菌浓比空白样高出3 4 这一结果可以用于种子培养基的优化。如图2 所示，在优化后的培养基中，细胞在4 7 小时的生长水平已经相当于未优化培养基中5 2 小时的水平。由此使用优化的培养基可以缩短发酵过程的生长期提前进入产酸，以缩短整个发酵周期，降低生产成本尽管酵母细胞的增
15、殖受钙离子和钙调素的调控已成为事实，但它调控酵母细胞增殖的完整信号转导过程目前还不清楚，有特进一步研究。另外还有人发现，M n “对酵母芽和核发育的作用效 果是C 矿的5 0 0 到1 0 0 0 倍，这也许表明M n ”才是这两个过程的生理调控因子【7 l 。这一结论对C a ”在细胞周期中所起的作用是独一无二的观点提出了挑战它也激励我们对各种微量元素在细胞生长中所起的作用进行进一步的探索。参考文献【I 】1R a n d a l lwe ta 1 ，H o wP r o t e o l y s i sD r i v e st h eC e l lC y c i c S c i e n c
16、e , 1 9 9 6 V 2 7 4 ( 6 ) , 1 6 5 2 - 1 6 5 9 口lP e t e r K H e p l e r ，C a c i u mT r a n s i e n t sd u r i n gM i t o s i s ：O b s e r v a t i o n si nF l u x ，T h eJ o u r n a lo f C c I IB i o l o g y , V t 0 9 f N o6 P c1 ) ，D e c 1 9 8 9 , 2 5 6 2 5 7 3 2 3 2【3 】H i d e t o s h i i d ada 1 C e l lC y c l eC o n t r o lb yc i n 船_ 册唧惴c e r e v , w h e ，T h
